猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF7 基因序列分析

樊振华，刘文俊，武守艳，吴 忻，孟 帆，焦福林，薛翼鹏

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种高度传染性疾病，临床上以怀孕母猪流产、早产、木乃伊胎、死胎、产弱仔等繁殖障碍以及仔猪严重呼吸道症状和高死亡率为特征[1]。1987 年美国首次报道发生猪繁殖与呼吸综合征，1991 年荷兰首次分离出该病病毒[2]，我国在1996 年首次从国内疑似PRRS 感染猪群中分离到PRRSV[3]。PRRSV 可分为以VR-2332 毒株为代表的美洲型和以Lelystad Virus（LV）毒株为代表的欧洲型，美洲型和欧洲型之间的核苷酸同源性为60%左右[4]。PRRSV 的基因组为不分节段的单股正链RNA，基因组全长约15 kb，含9 个相互重叠的开放阅读框（openreadingframe，ORF），即ORF1a、ORF1b、ORF2a、

ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6 和ORF7[5-7]，其中，由ORF7 基因编码的核衣壳（N）蛋白相对保守，是PRRSV 结构蛋白中含量最高的蛋白，具有良好的免疫原性和反应原性，在病毒组装和释放中发挥重要作用[8-9]，因此，ORF7 基因是检测PRRSV 的重要靶基因，N 蛋白是进行PRRS 血清学检测的重要靶蛋白。有研究发现[10]，不同PRRSV 毒株的ORF7基因序列之间有一定的差异性，这是应用ORF7 基因为靶基因、N 蛋白为靶蛋白对PRRSV 进行检测、诊断时需要考虑的重要因素。

本研究通过对山西地区检测的阳性样品的ORF7 基因序列进行分析，研究ORF7 基因的遗传变异情况，为研制PRRS 检测试剂盒提供参考，为山西地区PRRS 的综合防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试病料 供试材料为在山西省太原、长治、晋中等猪场无菌采集感染PRRSV 的发病猪的肺、扁桃体、脾、淋巴结、流产胎儿等组织，经RT-PCR 鉴定为PRRSV 阳性，-80 ℃保存。

1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus、Premix Taq、DNA Marker DL2000、PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、pMD18-T vector 等购自宝生物（大连）工程有限公司；SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒、SanPrep 核酸纯化套件（质粒提取）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；E.coli DH5α 菌株购自天根生物科技（北京）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物的设计与合成 用DNAStar 软件对GenBank 中PRRSV 的ORF7 基因进行序列分析，设计出扩增ORF7 基因的引物，预期长度为411 bp。引物序列为：ORF7-F：5′-GCTGTTAAACAGGGAGTGG Y-3′，ORF7-R：5′-GAGGCATCTCAGTGTTTGAA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 病毒总RNA 提取 按照RNAiso Plus 说明书操作，从PRRS 阳性病料中提取总RNA，用50 μL 0.1%DEPC 水溶解，-70 ℃保存。

1.2.3 PRRSV ORF7 基因RT-PCR 扩增、克隆与测序 以提取的RNA 为模板制备cDNA，按照Prime-ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 操作说明进行。在PCR 管中依次加入RNase free H2O7 μL、dNTP 1 μL、模板1 μL，ORF7-R 1 μL，混匀，65 ℃保温5 min 后，在冰上迅速冷却。在上述的PCR 管中依次加入RNase free dH2O 4.5 μL、5×PrimeScript II Buffer 4 μL、PrimeScript ⅡRTase 1 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL。PCR 反应体系：Premix Taq 25 μL、灭菌蒸馏水21 μL、cDNA 模板2 μL、ORF7-F 和ORF7-R各1 μL，混匀。PCR 反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR 扩增产物10 μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像仪下观察电泳结果。将回收后的PCR 产物连接pMD18-T载体，转化DH5a 感受态细胞，经鉴定的阳性菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.3 序列分析

用DNAstar 软件将获得的2 个PRRSV的ORF7基因序列与GenBank 中收录20 株PRRSV 的ORF7基因序列进行同源性比较并构建进化树。

2 结果与分析

2.1 PRRSV ORF7 基因的RT-PCR 扩增结果

以PRRS 阳性病料中提取的总RNA 为模板，用ORF7-F 和ORF7-R 进行RT-PCR 扩增，获得与预期大小一致的特异性片段，大小约411 bp（图1）。

2.2 ORF7 基因序列变化

获得2 个PRRSV ORF7 基因全长均为372 bp，无核苷酸插入和缺失。与VR-2332 毒株相比，2 株PRRSV 山西分离株ORF7 基因有25 个相同的核苷酸突变，分别为：8、126、137、143、192、234、255 位核苷酸由A→G，27、43、72、96、264、291 位由G→A，93、165、186、210、249、350 位由T→C，108、243、270、339 位由C→T，321 位由T→G，327 位由T→A。另外，CH_SXXG2_2015 的269 位由G→T。

2 个PRRSV ORF7 基因推导的氨基酸与VR-2332 相比，有6 个相同的氨基酸突变，分别为：第3 位氨基酸由N→S，第15 位由D→N，第46、48 位由K→R，第109 位由H→Q，第117 位由V→A。另外，CH_SXXG2_2015 的90 位由C→F。

2.3 ORF7 基因同源性分析

2 个PRRSV 毒株的ORF7 基因之间的核苷酸同源性为99.7%、氨基酸同源性为98.4%，与欧洲型代表毒株LV 核苷酸和氨基酸同源性分别为65.9%和58.1%，与美洲型代表毒株VR-2332 的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%～93.3%和93.5%～94.4%，与高致病性PRRSV 变异毒株（JXA1、HUN4、HEB1、HUB1）核苷酸和氨基酸的同源性分别97.6%～98.1%和95.2%～96.0%，与我国早期分离毒株CH-1a 核苷酸和氨基酸的同源性分别为94.6%～94.9%和91.9%～92.7%。

2.4 ORF7 基因的遗传进化分析

根据获得的2 个PRRSV ORF7 基因与Gen-Bank 中收录的20 株PRRSV ORF7 基因构建的进化树可知，PRRSV 毒株分为欧洲型和美洲型2 个基因型，欧洲型代表毒株LV 单独为一群，与其他毒株距离都很远；2 个PRRSV 毒株的ORF7 基因与美洲型代表毒株VR-2332 亲缘关系较近，与其他参考毒株同属于美洲型。美洲型又可分为2 个亚群，其中，第1 亚群包括BJ-4、VR-2332、HN1 和我国2006 年以后分离的4 株（GZ1101、HZ-31、HNyc15、QY2010）；本 研 究 获 得 的 2 个 ORF7 基 因（CH_SXLF7_2015、CH_SXXG2_2015）和 CH-1a、HB-2（sh）、我国2006 年以后分离的10 株（JXA1、SD-09、HUB1、HEB1、HUN4、Henan-A14、GD、GDQY2、GZgy15-1、GD-2011）组成第2 亚群（图2）。

3 结论与讨论

由ORF7 基因编码的N 是PRRSV 结构蛋白中含量最高的蛋白，具有良好的免疫原性和反应原性。因此，ORF7 是检测病毒的重要靶基因，N 蛋白是进行血清学检测的重要靶蛋白。

2 个PRRSV 山西分离毒株ORF7 基因之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.7%和98.4%，与美洲型代表株VR-2332 核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%～93.3%和93.5%～94.4%，与欧洲型代表毒株LV 核苷酸和氨基酸同源性分别为65.9%和58.1%，与高致病性PRRSV 核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6%～98.1%和95.2%～96.0%。遗传进化树分析结果表明，2 个PRRSV 山西分离毒株ORF7与欧洲型代表毒株LV 亲缘关系较远，与美洲型代表毒株VR-2332 亲缘关系较近，与CH-1a、HB-2（sh）、我国2006 年以后分离的10 株（JXA1、SD-09、HUB1、HEB1、HUN4、Henan-A14、GD、GDQY2、GZgy15-1、GD-2011）属于同一亚群。氨基酸变异分析结果表明，2 个PRRSV 山西分离毒株ORF7 基因与VR-2332 相比发生散在的点突变。大多数N 蛋白单抗识别N 蛋白中心区域第52—69 位氨基酸的序列[11]，山西省的2 个PRRSV 分离毒株在第52—69 位氨基酸之间没有发生变异，因此，针对N 蛋白建立的多种检测方法目前仍具有实用性。由于RNA 病毒不断变异，应该及时检测PRRSV 的变异情况，对PRRSV 检测方法不断进行研究，为PRRSV 的预警防控打好基础。