胡萝卜愈伤组织诱导条件筛选

刘真真，常双峰，冯羽飞，王晓东，武 喆

（1.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；2.临汾市农业环境监测站，山西临汾041000）

胡萝卜（Daucus carota L.）为伞形花科胡萝卜属2 年生草本植物[1]，其肉质根中含有丰富的胡萝卜素，具有较高的营养价值和药用价值。胡萝卜是植物组织培养研究中的经典材料[2]，具有良好的组织培养和遗传转化基础[3-4]，利用其不同组织进行愈伤组织诱导的研究有不少报道。陈豫等[5]以胡萝卜肉质根切段为外植体进行了诱导愈伤组织研究，结果表明，2，4-D 与6-BA 配合使用诱导效果较好。曹桦等[6]对胡萝卜嫩叶进行了组织培养研究，结果表明，1.0 mg/L2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA 是诱导松散型愈伤组织的最优激素配比。张唯等[7]以胡萝卜2 个月幼苗的根、茎、叶为外植体进行研究发现，以茎为外植体诱导愈伤组织的质量最好，诱导率和分化率最高。汪洪等[8]研究了激素、外植体、光照、培养基类型等因素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，结果表明，以下胚轴为外植体诱导愈伤组织较好，MS 培养基上添加1.0 mg/L 2，4-D 和0.5 mg/L KT 时愈伤组织的诱导频率为100%，光照不影响愈伤组织诱导。庄飞云等[9]研究了胡萝卜小孢子胚状体愈伤组织的诱导条件，认为B5 培养基中添加NAA 和2，4-D 可形成小孢子的愈伤组织，低温预处理对部分材料的小孢子愈伤组织的形成起一定作用。张娅等[10]研究不同外植体、培养基及激素配比对愈伤组织诱导的影响，结果显示，B5 培养基优于MS 培养基，2 种培养基中下胚轴的出愈率均高于子叶。郑回勇等[11]以胡萝卜新黑田五寸人参为材料研究不同激素处理对愈伤组织生长的影响，结果显示，以下胚轴诱导的愈伤组织质量和生长速度明显优于子叶，2，4-D与其他激素共同使用时的愈伤诱导效果明显好于单一激素，6-BA 的使用效果优于KT。由于组织培养的基因型依赖性较强，不同研究结果不尽相同。选择合适的基因型是建立稳定高效再生体系的基础[12]。在植物离体培养过程中，无论是外植体脱分化形成愈伤组织，还是愈伤组织经过器官发生途径或胚状体途径形成再生植株，都是激素协同作用的结果[13]。因此，对于特定品种胡萝卜的组织培养条件需要进一步探索。

本研究主要以17005 和19501 这2 个生产上主栽的胡萝卜品种为试材，以子叶和下胚轴为外植体，研究种子灭菌条件、培养基类型及激素配比对愈伤组织诱导的影响，以期为胡萝卜的高频再生和建立高效遗传转化体系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试品种 供试胡萝卜品种为17005 和19501，由山西农业大学园艺学院提供。外植体为上述这2 个品种萌发8～9 d 的子叶及下胚轴切段。

1.1.2 供试培养基 种子萌发阶段，采用1/2 MS培养基。愈伤组织诱导阶段，采用添加不同质量浓度2，4-D 和6-BA 的MS、B5 培养基，培养基的组成如表1 所示。

表1 培养基类型与激素含量

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的获得 将胡萝卜种子放入蒸馏水中浸泡过夜，用无水乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3 次，之后用不同的灭菌方式灭菌，即10%H2O2和20%H2O2溶液分别灭菌10、20 min，4%NaClO 分别灭菌10、15、20、30 min，再用无菌水冲洗3 次，用灭菌的滤纸吸干水分后，接种于不含激素的1/2 MS 固体培养基中，26 ℃黑暗条件下萌发8～9 d，诱导无菌苗，统计出苗率。

1.2.2 愈伤组织诱导 将萌发8～9 d 无菌苗的下胚轴和子叶切成0.5 cm 左右的小段，分别接种在添加不同激素的MS 和B5 培养基上诱导愈伤组织，置于26 ℃下暗培养，每次接种15 段子叶及20～25 段下胚轴，重复2 次，21～28 d 继代一次。

1.3 数据处理

采用SAS 软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌方法对胡萝卜无菌苗出苗的影响

由表2 可知，用20%H2O2溶液灭菌效果显著好于10%H2O2和4%NaClO 溶液，且幼苗生长情况良好，未出现污染。其中，20%H2O2溶液灭菌20 min时2 个品种的出苗率最高，17005 品种为57.1%，19501 品种为52.6%，显著高于其他处理。

表2 不同灭菌条件下2 个品种的出苗情况

2.2 基因型、外植体、培养基和激素对胡萝卜愈伤组织形成的影响

表3 不同基因型、培养基和激素浓度对胡萝卜子叶愈伤组织诱导的影响

由表3 可知，以子叶为外植体，17005 品种的M3 处理（MS＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）（图1-a）的出愈率显著高于M5 处理（B5＋1.0 mg/L 2，4-D），达93.3%，且出愈时间最短（21 d），愈伤组织生长速度快，但与其他处理间无显著差异。19501品种的M3 处理（MS＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）（图1-b）和M6 处理（B5＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）（图1-c）的出愈率显著高于其他处理，分别为80.0%和73.3%，但M3 处理愈伤组织出愈时间最短且生长速度最快；诱导效果最差的是M1 处理（MS＋0.5 mg/L 2，4-D）和M2 处理（MS＋1.0 mg/L 2，4-D），出愈率仅为13.3%和26.7%，显著低于M4 和M5 处理。2 个品种以子叶为外植体在培养基中添加2，4-D 和6-BA 的出愈效果都比仅添加2，4-D 的好。

从表4 可以看出，以下胚轴为外植体，17005品种的M3 处理（MS＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）（图1-d）和M6 处理（B5＋0.5 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）的出愈率都达到100.0%，显著高于M1，M4 和M5 处理，但M3 处理愈伤组织出愈时间（19 d）比M6 处理（22 d）少3 d，且愈伤组织生长速度快。19501 也是在M3 处理（图1-e）和M6（图1-f）处理出愈率最高，分别为92.0%和94.2%，与其他处理差异不显著，但M3 出愈时间（18 d）比M6 出愈时间（19 d）少1 d。2 个品种以下胚轴为外植体在培养基中添加2，4-D 和6-BA 的出愈效果都比仅添加2，4-D 的好。

综合表3 和表4，2 个品种的外植体均是以下胚轴诱导的愈伤组织出愈率最高，17005 的诱导率达到100.0%，19501 诱导率也都在90.0%以上。在MS 和B5 培养基中同时添加2，4-D 和6-BA 诱导愈伤组织的效果均较只添加2，4-D 的好。在最佳诱导条件下利用MS 和B5 培养基的诱导效果差异不显著。

3 结论与讨论

愈伤组织诱导过程中受多重因素影响，主要可以分为灭菌条件[14]、基因型[15]、外植体类型[7，16]、培养基类型[11]、激素配比等多个因素。

生长状态良好的无菌苗的获得与种子灭菌结果有直接关系，张唯等[7]选用75%乙醇＋84 灭菌液（主要成分为NaClO）与无菌水1∶1 配制的灭菌溶液进行灭菌；张娅等[10]使用75%乙醇＋0.1%升汞溶液灭菌；郑回勇等[11]用75%酒精和2%的NaClO 溶液灭菌；ANNON 等[17]仅用70%的乙醇消毒30 s；杨艳梅等[18]用70%酒精和1%的AgNO3进行振荡灭菌，能够获得生长旺盛的无菌苗。本研究利用以上灭菌方法均未达到良好的灭菌效果，因此对灭菌条件进行探索，试验结果证明，无水乙醇＋20%H2O2溶液灭菌20 min 的效果最佳，无菌苗长势较好。

愈伤组织诱导存在基因型和外植体的差异。本试验以17005 及19501 种子萌发8～9 d 无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，进行愈伤组织诱导。结果显示，2 个基因型以下胚轴为外植体的诱导效果均高于子叶，诱导率都在92.0%以上，这与汪洪等[8]、张娅等[10]和郑回勇等[11]的研究结果一致。

激素的配比[19]和培养基也是诱导愈伤组织的重要影响因素。生长素在愈伤组织诱导中起决定性作用，细胞分裂素则刺激细胞分裂，增加愈伤组织发生的数量。本试验表明，MS 和B5 培养基在最佳处理组合（分别同时添加0.5 mg/L 2，4-D 和0.5 mg/L 6-BA）下对愈伤组织的诱导无显著差异。汪洪等[8]研究认为，胡萝卜七寸人参在同一激素条件下MS培养基诱导效果较B5 培养基好。高金秋等[20]研究表明，长城红钥对B5 和MS 培养基均表现适应，而开拓者仅在B5 培养条件下表现较好。说明胡萝卜愈伤组织诱导的适宜培养基依赖于基因型。一定浓度的2，4-D 和6-BA 共同使用较单独使用2，4-D对愈伤组织的诱导效果好，这与汪洪等[8]和郑回勇等[11]的研究结果相同。