水稻OsBGAL1 基因的亚细胞定位分析

李军玲，孙林静，王晓静，闫双勇，张融雪，苏京平，孙 玥

（天津市农作物研究所，天津市农作物遗传育种重点实验室，天津300384）

β-半乳糖残基常见于糖脂（Monogalactosyldiacyl-glycerol，MGDG）[1]、蛋白多糖（Arabinogalactan proteins，AGPs）[2]和细胞壁多糖（木葡聚糖（Xyloglucans）和鼠李半乳糖醛酸聚糖I（Rhamnogalacturonan I，RGI））[3]等。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，BGAL）（EC3.2.1.23）广泛分布于植物、动物、微生物中，是一类糖苷水解酶（Glycoside hydrolases，GHs），能够从β-D-半乳聚糖或寡糖支链非还原末端切除β-半乳糖残基。植物BGALs 属于GH35 基因家族，其通过对细胞壁的重塑参与多种植物生理过程，包括参与果实成熟软化、花器官的发育、种子萌发和胚根伸长等。如AtBGAL6 基因T-DNA 插入失活后导致拟南芥种子黏液（一种特殊的次生细胞壁）不能释放[4]，AtBGAL10 基因T-DNA 插入失活后导致果荚和萼片变短[5]。番茄TBG4、TBG6 基因[6-7]、草莓FaβGal4 基因[8]、柿子DkGAL1 基因[9]、桃子PpBGAL10、PpBGAL16 基因[10]都与果实软化相关。

水稻基因组中含有15 个BGALs 基因，根据进化聚类分析可以分成a1（OsBGAL1-3、OsBGAL7）、a2（OsBGAL13）、a4（OsBGAL8）、a5（OsBGAL4）、b（OsBGAL5、OsBGAL12、OsBGAL14、OsBGAL15）、c1（OsBGAL10-11）、c2（OsBGAL6）、d（OsBGAL9）8 个亚家族，所有水稻BGALs 基因的生理功能都不清楚，15 个成员中只有OsBGAL1、OsBGAL2、OsBGAL13 被证明具有生化活性[11-12]。2007 年Mallika CHANTARANGSEE 等[11]从生长10 d 的水稻幼苗中分离得到OsBGAL1（Os03g0165400）和OsBGAL2（Os03g0165400）蛋白，其中，体外表达的OsBGAL1融合蛋白可以水解β-（1-3）-、β-（1-4）-、β-（1-6）-连接的半乳二糖和半乳三糖、p-硝基苯基β-D-半乳糖苷和p-硝基苯基β-D-岩藻糖苷；OsBGAL1在15～30 d 水稻幼苗的根、地上部和叶鞘中表达较高，但在花和未成熟的种子中表达量很低。

为了深入研究OsBGAL1 基因的生物学功能，本研究克隆获得其ORF 序列，通过酶切连接成功构建pBWA（V）HS-OsBGAL1-GFP 亚细胞定位载体，转化农杆菌，并利用农杆菌介导的烟草瞬时表达方法进行亚细胞定位观察，以期为深入分析OsBGAL1基因可能参与的生物学过程提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试的日本晴（Oryza sativa L.Japonica cv.Nipponbare）种子、本氏烟草（Nicotiana benthamiana）种子、大肠埃希氏杆菌DH5α、农杆菌菌株GV3101、植物表达载体pBWA（V）HS-GFP 均是由天津市农作物遗传育种重点实验室保存。

质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，高保真Taq 酶购自宝日医生物技术（北京）有限公司（Code No.R010Q），反转录试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司（Code No.6210A），内切酶Eco31I、Eco32I 购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，其他生化试剂购自索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 日本晴cDNA 的制备 采用Trizol 法提取日本晴生长10 d 幼苗的总RNA，利用反转录试剂盒反转录为cDNA，反应体系如表1 所示，65 ℃，10 min；42 ℃，50 min；95 ℃，5 min。将制备好的cDNA 置于-20 ℃保存备用。

表1 反转录反应体系

1.2.2 亚细胞定位瞬时表达载体的构建 根据水稻OsBGAL1 基因在NCBI 数据库中序列设计引物，以日本晴cDNA 为模板，PCR 扩增带有Eco31I酶切位点的OsBGAL1 的ORF 全长（去除终止子）。PCR 引物为OsBGAL1（+）：cagtGGTCTCacaacatgggg agggggtgcctggc；OsBGAL1（-）：cgatGGTCTCatgcagcgg tagagcataccg。采用50 μL 体系进行PCR 反应，如表2 所示。PCR 反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸100 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增完成后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，对目的基因片段进行切胶回收并纯化。将载体pBWA（V）HS-GFP 和纯化的基因片段用Eco31I 进行酶切回收后，用T4 连接酶连接载体和基因片段；随后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR 筛选阳性克隆，提取质粒后进行酶切验证，并测序分析；保存测序正确的菌种并命名为pBWA（V）HS-OsBGAL1-GFP。

表2 PCR 反应体系

1.2.3 pBWA（V）HS-OsBGAL1-GFP 在烟草叶片中瞬时表达和亚细胞定位 将质粒pBWA（V）HSOsBGAL1-GFP 电转化农杆菌GV1301，30 ℃培养2 d；挑取鉴定正确菌斑，用液体LB 培养基（含卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（25 μg/mL））培养至对数生长期；取菌液2 mL，4 000 r/min 离心5 min，弃上清液收集菌体；将收集的菌体用农杆菌悬浮液（10 mmol/L 的MES（pH 值5.7）、10 mmol/L MgCl2和120 μmol/L乙酰丁香酮）悬浮，调整菌液浓度OD600至0.7 左右；挑选生长30 d 左右状况良好的烟草植株，用去针头的1 mL 注射器从烟草叶片下表皮注射农杆菌悬浮液，做好相应标记，将注射完成的烟草植株弱光条件下培养2 d，剪取有标记的农杆菌注射的烟草叶片制成玻片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

2 结果与分析

2.1 OsBGAL1 基因的克隆与亚细胞定位载体的构建

以日本晴cDNA 为模板，扩增OsBGAL1 基因到终止密码子前的全长ORF 序列，全长2 523 bp。将目的片段连接到pBWA（V）HS-GFP 载体上，转化大肠杆菌DH5α，PCR 鉴定阳性克隆质粒，并用Eco32I 酶切验证后进行测序，测序结果表明（图1），克隆序列正确，载体构建成功。

2.2 OsBGAL1 蛋白质的亚细胞定位

用打孔器将侵染2 d 的烟草叶片剪去，并在激光共聚焦显微镜下观察（图2）。由图2 可知，pBWA（V）HS-GFP 空载体对照的绿色荧光分布于细胞内各个组分，如细胞膜、细胞核、内质网等，OsBGAL1与pBWA（V）HS-GFP 表达载体融合后，绿色荧光信号主要分于细胞壁上或细胞膜上。

3 结论与讨论

目前，已有试验证明，BGALs 定位于细胞壁，与其参与细胞壁重塑功能一致。拟南芥AtBGAL1、AtBGAL2、AtBGAL5、AtBGAL6、AtBGAL8、AtBGAL12等被用不同的方法如免疫金标记、点杂交、GFP 融合蛋白、蛋白质组学等证明定位于细胞壁[4，13-15]；苹果Mdβ-Gal1、Mdβ-Gal2、Mdβ-Gal5 这3 个基因的GFP 融合表达载体在洋葱表皮细胞瞬时表达结果证明，3 个基因全部定位于细胞壁[16]。本研究利用GFP融合蛋白及烟草瞬时表达技术对水稻OsBGAL1 基因进行了亚细胞定位，激光共聚焦观察结果表明，与空载相比，OsBGAL1 蛋白在细胞中的分布存在差异，与AtBGAL6 的烟草亚胞定位结果相似，主要定位于细胞壁，结合其生化活性，揭示其可能通过对细胞壁的重塑发挥重要生理功能。