核桃叶片多酚类物质积累及相关酶活性分析

王玉琼，刘群龙，牛铁荃

（山西农业大学园艺学院，山西太谷030801）

核桃不仅营养丰富，而且风味独特，所以成为四大干果之首，是坚果类果树的重要树种，也是油料树种，其种子、树皮、青皮、叶片被广泛应用于制药业和化妆品产业[1-2]。医学工作者认为，核桃叶可治疗出汗、皮肤病、溃疡，同时防止出血、预防泻、能赶虫，这主要得益于其富含的酚酸[3]、类黄酮、萘醌等多酚类物质。以往对核桃种群中的Lara、Franquette、Marbot、Mayette 等品种以及西南地区的铁核桃进行了多酚类物质的研究[1，4]，而对黄土高原栽植的中林5 号、香玲、礼品1 号、礼品2 号未见报道。

本试验选取4 个山西省农业科学院果树研究所栽植核桃品种（中林5 号、香玲、礼品1 号、礼品2 号）为试材，采用动态取样的方法[5]，研究叶片发育进程中各类单体酚的含量变化及相关酶活性的变化，以明确核桃叶片在不同发育时期多酚类物质积累与相关代谢酶活性的关系，为合理调控多酚类物质积累和提高核桃相关代谢酶活性奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试核桃品种为中林5 号、香玲、礼品1 号、礼品2 号，树龄20 a（盛果期）。

1.2 试验方法

试材于2018 年5—9 月在山西省农业科学院果树研究所（37.35°N，112.51°E）采集。4 个品种的核桃分别于5 月25 日、7 月5 日、8 月18 日、9 月4 日对生长在树冠中的外围枝条复叶接近的基部叶片进行采集，用装有冰块的泡沫盒快速拿回实验室，分样并进行液氮冷冻，之后于-80 ℃的冰箱中冷冻保存备用，并在液氮环境下进行研磨。

1.2.1 核桃叶片中多酚类物质的提取 称取0.5 g研磨好的核桃叶片，加入10 mL 体积分数为50%的甲醇水溶液，研磨成匀浆，放置在50 ℃、40 kHz 的超声波中提取40 min。提取液经12 000 r/min 离心10 min，即得多酚提取液。置于4 ℃下冷藏备用。

1.2.2 高效液相色谱测定核桃叶片单体酚 用0.22 μm 滤膜对多酚提取液进行过滤，自动装置进样。色谱条作为：色谱仪（UltiMate UltiMate 3000），Venusll ASB C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）[6]。0.8%乙酸作为流动相A，色谱甲醇作流动相B，柱温为25℃，进样为10μL，流速为0.9mL/min。采用2 种梯度洗脱方法，分别是：方法1（测核桃叶片中的没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸）.0～10 min，10%～20%B；10～25 min，20%～50%B；25～35 min，50%B；35 ～40 min，50%～55%B；40 ～45 min，55%～10%B；检测波长为280 nm；方法2（测核桃叶片中的丁香酸、丁香醛、对香豆酸、阿魏酸、芦丁、杨梅素、胡桃醌、槲皮素）.0～10 min，10%～40%B；10～25 min，40%～60%B；25 ～35 min，60%～80%B；35～45 min，80%～10%B；检测波长为251 nm[7]。

1.2.3 酶标仪测定核桃叶片酶活性 采用酶标仪、酶联免疫试剂盒对3-脱氧-阿拉伯庚酮酸糖-7-磷酸合酶（DAHPS）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、分支酸变位酶（CM）、柠檬酸合酶（CS）、查尔酮合成酶（CHS）活性进行测定。

1.3 数据统计分析

用Excel 2010 和SPSS 23.0 进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 核桃叶片中多酚含量动态变化和组成分析

不同品种核桃各单体酚含量间存在差异[8]。由表1 可知，没食子酸含量由高到低为：礼品2 号＞中林5 号＞香玲＞礼品1 号；绿原酸、咖啡酸、丁香酸含量由高到低为：中林5 号＞礼品1 号＞香玲＞礼品2 号；丁香醛含量由高到低为：礼品2 号＞礼品1 号＞香玲＞中林5 号；儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素含量由高到低为：中林5 号＞礼品1 号＞礼品2 号＞香玲；对香豆酸含量由高到低为：中林5 号＞香玲＞礼品1 号＞礼品2 号；阿魏酸、胡桃醌含量由高到低为：中林5 号＞礼品2 号＞香玲＞礼品1 号。

核桃在不同时期各单体酚的含量存在显著差异。由表1 可知，在中林5 号核桃叶片中，儿茶素、芦丁的平均含量较高，分别为2 280.90、2 266.40 μg/g；丁香醛和没食子酸的平均含量较低，分别为19.91、41.43 μg/g。12 种单体酚[9]分别表现出3 种变化趋势。没食子酸、绿原酸、儿茶素、丁香酸、咖啡酸、胡桃醌、对香豆酸、槲皮素的含量呈现先下降再升高，最后下降的趋势；阿魏酸、丁香醛的含量呈“N”型变化趋势；芦丁和杨梅素呈前期一直升高，最后下降的趋势。在香玲核桃叶片中，芦丁的平均含量最高，其次为儿茶素，分别是1 628.21、1 002.20 μg/g；平均含量较低的是丁香醛和没食子酸，分别为27.27、30.74 μg/g。12 种单体酚也表现出3 种变化趋势。没食子酸、芦丁、绿原酸、杨梅素的含量呈现先下降再升高最后下降的趋势；咖啡酸、丁香醛、丁香酸、阿魏酸、对香豆酸、胡桃醌[10]的含量呈先下降，然后一直升高的“√”型变化趋势；儿茶素的含量在整个发育过程中一直升高；芦丁的含量在5 月与9 月之间相差不大。在礼品1 号核桃叶片中，芦丁的平均含量最高，其次是儿茶素，分别为1 996.38、1 281.80 μg/g；平均含量较低的是丁香醛和没食子酸，分别为29.92、30.43 μg/g。不同于以上2 个品种的核桃，在礼品1 号核桃叶片中12 种单体酚表现出了5 种变化趋势。没食子酸、绿原酸、芦丁、胡桃醌的含量呈现先下降再升高最后下降的趋势；咖啡酸、杨梅素、丁香酸的含量呈现先下降，然后一直升高的“√”型变化趋势；丁香醛、阿魏酸、对香豆酸的含量前边一直下降，最后上升；槲皮素的含量在前期呈现一直上升，最后下降的趋势；儿茶素的含量在整个发育过程中一直上升。在礼品2 号核桃叶片中，芦丁的平均含量最高，其次是儿茶素，分别是1 922.10、1 074.69 μg/g；平均含量较低的有丁香醛、对香豆酸、丁香酸，分别为32.48、32.74、35.68 μg/g。礼品2 号核桃叶片中12 种单体酚和礼品1 号核桃叶片中12种单体酚相似，也表现出5 种变化趋势。儿茶素、芦丁、绿原酸、胡桃醌、杨梅素这5 种单体酚的含量呈现先下降再升高最后下降的趋势；没食子酸、槲皮素的含量呈先下降后一直升高的“√”型变化趋势；咖啡酸、丁香醛的含量在前期呈现一直上升，最后下降的趋势；丁香酸、对香豆酸的含量在整个发育过程中呈现一直上升的趋势；阿魏酸的含量呈“N”型变化趋势。

表1 核桃叶片发育过程中单体酚含量动态变化 μg/g

从表1 可以看出，没食子酸的含量在核桃叶片 的整个发育周期中含量偏低，7 月5 日的叶片中，仪器已检测不到它的存在；在9 月4 日，中林5 号、礼品1 号叶片中未见到有没食子酸存在。儿茶素在核桃叶片整个发育过程中的含量偏高，并随着时间的推移逐渐到达顶峰，8 月18 日和9 月4 日含量分别为1 831.02、1 964.97 μg/g；咖啡酸、丁香醛、槲皮素[11]含量在整个发育周期中含量较为稳定；丁香酸在5 月25 日和9 月4 日含量较高，分别为101.67、104.16 μg/g；阿魏酸在8 月18 日含量最低，为39.10 μg/g，在9 月4 日含量最高，为109.46 μg/g；绿原酸、对香豆酸、芦丁、杨梅素、胡桃醌的含量皆在8 月18日达到顶峰，分别为774.31、87.59、2 614.00、1 255.58、619.07 μg/g。

综上可得，核桃叶片多酚类物质的含量在其生长周期呈现大致的变化规律为：在5 月25 日至7 月5 日多酚类物质含量下降，在7 月5 日至8 月18 日表现出上升趋势，在8 月18 日至9 月4 日多酚类物质有所下降。根据HPLC[5-6]鉴定出核桃叶片中含有没食子酸、绿原酸、儿茶素、丁香酸、咖啡酸、丁香醛、阿魏酸、对香豆酸、芦丁、胡桃醌、杨梅素、槲皮素，共12 种单体酚；含量较高的有芦丁、儿茶素；含量较低的有没食子酸、丁香醛等。核桃叶片中大多数单体酚在7、9 月含量较低，在5、8 月含量较高。

2.2 核桃叶片中多酚类物质的相关代谢酶活性分析

由图1 可知，大部分酶活性随着时间的推移而升高，活性最高的酶有3-脱氧-阿拉伯庚酮酸糖-7-磷酸合酶（DAHPS），其次是肉桂酸-4-羟化酶（C4H），最低的为柠檬酸合酶（CS）。香玲、礼品1 号的查尔酮合成酶活性在8、9 月比5、7 月多1 倍，分支酸变位酶活性种间差异很小。

2.3 酶活与多酚含量、酶活的相关性分析

表2 酶活与多酚含量的相关性分析

各种酶活性与多酚类物质含量相关性如表2所示。由表2 可知，没食子酸、咖啡酸、儿茶素、槲皮素、阿魏酸、芦丁、胡桃醌、杨梅素与大部分酶活性呈正相关；绿原酸、丁香醛、丁香酸、对香豆酸与大部分酶活性呈负相关。柠檬酸合酶（CS）与大部分单体酚呈负相关，其余酶活与大部分单体酚呈正相关。酶活性与单体酚含量相关关系均未达到显著水平。

由表3 可知，酶活之间的相关关系皆为正相关，且大都达到显著水平。DAHPS 与C4H、CHS、CM间呈极显著正相关；C4H 与CHS、CS、CM 间呈极显著正相关；CHS 与CM间呈极显著正相关，与CS 呈显著正相关。

表3 酶活之间的相关性分析

3 结论与讨论

张素斌等[12]研究了乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间、提取次数5 个因素对龙利叶多酚提取的影响。朱亚等[13]明确了茶多酚和溶菌酶对冷鲜肉的保鲜效果，研究了不同浓度茶多酚和溶菌酶对冷鲜肉感官品质、菌落总数和理化指标的影响。靳双珍等[14]研究了烤烟颜色特征值的变化对多酚类物质含量的影响。葛坤等[15]研究了热激处理对引起大花蕙兰褐变的总酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）生理指标的影响。陈亮等[16]以西瓜枯萎病鉴别寄主，研究接种处理后西瓜叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）活性的变化，明确了西瓜枯萎病抗性与抗氧化、次生代谢相关酶活性的关系。侯名语等[17]探讨了生态环境对花生种子黄酮、多酚及两者变化与初生代谢物脂肪、总糖含量变化的相关性。张倩茹等[18]研究了XDA-1、XDA-5、XAD-16、AB-8、LH-20 国内外5 种不同大孔树脂对苹果多酚的吸附规律以及XAD-16 的解吸特性。

AMARAL 等[7]研究了多酚类物质含量在6 个核桃品种叶片中的变化，结果表明，酚酸、黄酮、总酚含量在5—6 月呈下降趋势，7 月呈上升趋势，8—9 月又呈下降趋势。本研究表明，核桃叶片多酚类物质含量在其生长周期呈现一定的变化规律：5 月25 日至7 月5 日是核桃叶片的快速生长期，多酚类物质合成速率小于叶片的增长速率，所以，多酚含量呈下降趋势；7 月5 日至8 月18 日，叶片生长处于基本停滞状态，所以，多酚含量呈上升趋势；8 月18 日至9 月4 日，多酚物质的含量有所下降。史斌斌等[7]研究表明，在8—9 月核桃叶片多酚含量降低可能与多酚类物质的合成及分解的平衡失调有关联。前人研究表明，夏季叶片多酚含量迅速上升可能与强光照诱导有关。

本研究表明，12 种单体酚中含量最高的为芦丁，其次为儿茶素，含量较低的有没食子酸、丁香醛等。核桃叶片中大多数单体酚在7、9 月含量较低，在5、8 月含量较高。不同品种核桃间各单体酚含量存在差异。在4 个核桃品种的叶片中没食子酸含量由高到低为：礼品2 号＞中林5 号＞香玲＞礼品1 号；绿原酸、咖啡酸、丁香酸的含量由高到低为：中林5 号＞礼品1 号＞香玲＞礼品2 号；丁香醛的含量由高到低为：礼品2 号＞礼品1 号＞香玲＞中林5 号；儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素的含量由高到低为：中林5 号＞礼品1 号＞礼品2 号＞香玲；对香豆酸的含量由高到低为：中林5 号＞香玲＞礼品1 号＞礼品2 号；阿魏酸、胡桃醌含量由高到低为：中林5 号＞礼品2 号＞香玲＞礼品1 号。本研究中大部分酶活性随着时间的推移而升高，含量最高有3-脱氧-阿拉伯庚酮酸糖-7-磷酸合酶（DAHPS），其次是肉桂酸-4-羟化酶（C4H），最低的为柠檬酸合酶（CS）。希望可以通过对这些试验报告数据的分析、对比与讨论，为进一步深入了解核桃提供参考依据。