胃癌术后病人肠道菌群变化及其对围手术期恢复的影响

田华开，郑辞华，刘韦东，许添，温华斌，邓小荣

(南昌大学第二附属医院胃肠外科，江西 南昌 330006)

目前，胃癌的治疗方法包括手术治疗、放化疗、基因疗法和免疫治疗等，其中，手术治疗是胃癌最常见最有效的治疗方法[1-2]。有资料显示，手术创伤应激可影响肠道菌群平衡、肠内炎症以及肠黏膜损害，从而影响病人术后恢复、预后以及生活质量[3-4]。近年来，胃肠道微生态系统受到广泛关注，胃肠道微生物约占人体微生物的76%[5]。胃肠道微生物种类庞大，数量繁多，参与机体的代谢，对人类健康有着极其重要的作用[6-7]。胃癌术后病人由于手术创伤、消化道重建造成解剖关系改变，肠道菌群可能发生变化，同时，胃肠道微生物对胃癌术后病人的恢复存在哪些影响还有待探讨。本研究应用高通量测序等方法检测胃癌病人手术后的肠道菌群变化，及其对病人术后恢复的影响。现报告如下。

资料与方法

一、资料

收集2018年6月至2019年6月南昌大学第二附属医院胃肠外科收治的行胃癌根治术的100例病人，其中男性84例，女性16例，年龄(54.4±8.9)岁。纳入标准：①病理确诊为胃癌病人；②年龄为40～70岁，无严重心脑血管疾病、肝肾功能损害病人；③术前检查无远处器官转移，术前未行放疗、化疗病人。排除标准：①病人营养状态差(总蛋白<70 g/L,白蛋白<40 g/L),术前存在贫血；②病人有糖尿病等内分泌代谢性疾病；③病人有感染性疾病。

二、方法

术前(未行肠道准备前)收集病人粪便行肠道菌群检测，采集新鲜的、中后段、内部的粪便标本2 g，立即置于-80 ℃冷冻保存，保存期间勿反复冻融，以免损伤菌群。所有病人在完善相关术前准备后均于全身麻醉下行远端胃大部分切除伴胃空肠吻合术，术后均给予头孢替安(2 g)每12 h一次静脉输液预防感染，一般常规使用48～72 h后停止。术后第1天开始均给予营养支持治疗，待病人恢复饮食(稀饭或面条)、解黄色稀便后(约8～10 d)收集病人粪便标本，同术前标本低温保存，同时记录病人术后首次通气通便时间，待所有标本收集完毕后一起送检，提取粪便样本DNA，通过高通量测序检测分析样本中肠道菌群种类及丰度。

粪便DNA提取及高通量测序：将上述低温(-80 ℃)保存的粪便标本联合使用基因组DNA试剂盒(中国北京天根生物技术有限公司)和珠子敲打的方法，通过分光光度计在230 nm和260 nm确定其浓度和质量。然后使用515F/806R(515F，5′-GTGCCAGCMGCCGCGGGGTAA-3′; 806R，5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′)的引物扩增每个样品中16S rDNA基因的V4区，并使用Illumina HiSeq 2000平台(GenBank登录号SRP155279)对这些PCR产物进行测序。菌群DNA提取流程见图1。

三、观察指标

比较100例病人手术前后肠道菌群(双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、大肠杆菌、链球菌等)变化，术后各菌群丰度。观察记录病人术后首次恢复通气通便时间，术后是否出现腹痛、腹胀等症状。收集病人术后炎症指标(白细胞计数、中性粒细胞百分比、C反应蛋白)，免疫指标(淋巴细胞计数、淋巴细胞百分比)，营养指标(总蛋白、白蛋白和前白蛋白)等临床数据资料。

四、统计学方法

结 果

一、手术前后病人肠道菌群变化

所有病人粪便样本经过高通量基因检测后发现，肠道菌群种类未见明显变化，各菌群的相对丰度即数量手术前、后发生改变：其中双歧杆菌(15.68%比3.06%)、嗜乳酸杆菌(21.6%比4.74%)平均相对丰度发生明显改变，术后较术前明显减少；而大肠杆菌(8.67%比14.34%)、链球菌(12.61%比26.75%)平均相对丰度术后较术前明显增加，差异有统计学意义(P<0.05 )，见图2。

二、肠道菌群改变对病人术后恢复影响

根据不同病人有益菌相对丰度是否大于上述平均丰度，将100例病人分为相对丰度高组和相对丰度低组，比较两组病人术后恢复情况，探究肠道菌群对术后恢复的影响。相对丰度高组54例，男性47例，女性7例，均未予以输血；相对丰度低组46例，男性37例，女性9例，均未予以输血。两组病人年龄、性别、手术时间、术中出血量等差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。100例病人均未出现吻合口漏，5例病人因皮下脂肪层较厚术后出现手术切口脂肪液化，经加强换药后伤口愈合良好，所有病人术后均顺利出院。

观察病人术后恢复情况及相关血液生化指标发现，有益菌相对丰度高组术后首次通气通便时间较相对丰度低组明显缩短，相对丰度高组术后出现腹痛、腹胀病人2例，相对丰度低组术后出现腹痛、腹胀病人8例，所有病人经过适当活动、通便、恢复饮食后(粪便标本已取)给予口服双歧杆菌四联活菌片后症状均缓解，两组病人结果差异有统计学意义(P<0.05)。通过收集病人术后生化指标发现，相对丰度高组炎症指标(白细胞计数、中性粒细胞百分比、C反应蛋白)异常例数较相对丰度低组明显较少，免疫指标(淋巴细胞计数、淋巴细胞百分比)异常例数较相对丰度低组明显较少，差异均有统计学意义(均P<0.05)；相对丰度高组术后营养状态(总白蛋白、白蛋白、前白蛋白)较相对丰度低组有明显改善，差异有统计学意义(P<0.05)。(表1)

讨 论

手术治疗能够显著延长胃癌病人生存时间[8-9]。但手术创伤会影响肠道菌群变化，有研究显示，手术创伤应激能够改变病人术后肠黏膜通透性、导致菌群紊乱，加剧肠内炎症反应，降低免疫力，直接影响病人术后恢复[10]。胃癌手术所致炎症反应，促使白细胞介素6、肿瘤坏死因子水平明显上升，免疫因子表达下降，同时肠黏膜屏障受损，肠道细菌移位使肠道炎症进一步加重形成恶性循环[11-13]。目前，关于胃癌术后肠道菌群变化的研究甚少，本研究通过提取粪便标本DNA，应用高通量测序的方法检测肠道菌群种类及相对丰度变化，探讨其对术后恢复的具体影响，为临床促进胃癌病人围手术期加速康复提供新的方案。

表1 两组病人术后恢复情况比较

目前已知，人体内存在着上千种微生物，对宿主的新陈代谢起着重要的作用。正常微生物群、宿主和环境之间始终处于动态平衡状态，形成一个相互依存、相互制约的系统，这个平衡一旦破坏，就可能导致机体功能紊乱。肠道微生物对于肠道功能发挥着重要的作用，能够明显促进肠道蠕动，减少有害菌产气，促进肠道有害物质排出，促使肠道充分发挥肠道屏障功能。有研究表明，肠道菌群能够帮助机体消化食物，分解毒素，合成多种人体生长发育必需的一些维生素和必需氨基酸，并参与糖类和蛋白质的代谢，抵御入侵者，调节机体免疫功能，对人类的健康有着极其重要作用[14- 15]。胃肠道菌群大致可分为有益菌、有害菌和中性菌[16]。有益菌，也称之为益生菌，主要是各种双歧杆菌、乳酸杆菌等，是人体健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制有害菌和致病菌群的生长，分解有害、有毒物质等[17- 18]。中性菌，即具有双重作用的细菌，如大肠杆菌、肠球菌等，当机体功能发生紊乱，增殖失控，将导致宿主表现各种症状[19-20]。

本次研究收集胃癌手术病人手术前后的粪便标本，通过高通量基因测序的方法检测样本中肠道菌群的种类和数量变化。结果表明，胃癌术后病人肠道菌群种类无明显改变，但各菌群相对丰度发生明显改变，体内双歧杆菌、嗜酸乳杆菌相对丰度明显降低，大肠杆菌、链球菌等相对丰度明显增加。同时，通过检测胃癌病人术后体内各菌群数量变化及病人术后恢复情况、生化指标发现，术后体内有益菌相对丰度高的病人炎症指标、淋巴细胞更趋于正常，病人术后营养状态较好，术后首次通气通便时间明显缩短，腹痛腹胀等临床表现明显减少。

通过本次研究发现，胃癌手术病人术后肠道菌群种类未见明显改变，各肠道菌群相对丰度发生明显变化，术后体内益生菌明显减少，大肠杆菌、链球菌相对丰度明显增加，导致病人术后抵抗力下降。同时，体内有益菌丰度相对较高组具有更快的术后恢复能力，能明显减少机体炎症反应，提高机体免疫能力，增强病人术后营养状态。

综上所述，手术治疗影响胃癌病人肠道菌群平衡，这可能与手术应激以及消化道重建改变胃肠生理结构(胃肠液酸碱失衡)有关。另外，肠道菌群变化、炎症指标与病人术后恢复密切相关，提示调节肠道菌群平衡，即增加肠道有益菌有助于降低炎症反应，促进胃癌病人术后恢复。