巴戟天不同炮制品对大鼠肝药酶CYP3A 的影响

陈 红，蔡真真，林丽虹，张清华，程再兴

（福建中医药大学药学院，福建 福州350122）

细胞色素P450 酶素（CYP）中的CYP3A 参与临床约50%药物的代谢，是最重要的P450 酶之一，同时CYP3A 被诱导或抑制是药物产生代谢性相互作用的主要原因。 研究药物对CYP3A 的影响，可以预测药物间的相互作用，从而提高疗效，减少不良反应［1-2］。 巴 戟 天 为 茜 草 科 植 物 巴 戟 天（Morinda Officinalis How）的干燥根，有补肝肾、强筋骨、祛风湿的作用，为“四大南药”之一，临床中除用生巴戟天饮片外，还有盐巴戟天和制巴戟天饮片，其不同饮片的功效和临床应用各有侧重。现代研究发现，巴戟天不仅具有与功效相关的镇痛、抗炎、抗风湿等药理作用外，还有抗肿瘤、抗抑郁等作用［3-5］，而巴戟天对肝药酶的影响研究较少，本文通过采用肝微粒体体外温孵法、定量PCR 和Western blot 技术，观察巴戟天不同炮制品对CYP3A 活性、蛋白及mRNA 表达的影响，为巴戟天临床配伍用药和深入研究其炮制机理提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠，体质量180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2012-0002。

1.2 实验药材 巴戟天产自福建永定，经福建中医药大学药学院范世明高级实验师鉴定为茜草科植物巴戟天（Morinda Officinalis How）的干燥根，符合2015 版《中国药典》的要求。

1.3 试剂与仪器 苯甲基磺酰氟化物、二硫苏糖醇（美国Sigma-Aldrich 公司）；Agilent 1290 超高效液相色谱仪（UPLC，美国Agilent 公司）；Elix 超纯水系统 （美国Milipore 公司）；solutionA、B （还原型辅酶A、B 溶液，美国BD biosciences 公司）；睾酮、6β-羟基睾酮（日本nacalaitesque 公司，纯度＞98%）；吉非贝齐（内标，美国Sigma-Aldrich 公司，纯度＞98%）；乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；大鼠CYP3A 抗体一抗（兔抗鼠抗体，美国Abcam 公司）；二抗（羊抗兔抗体，美国Santa Cruz 公司）；BT25S型精密电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；CS150NX型超高速离心机（日本Hitachi 公司）；pH计（瑞士Mettler Toledo 公司）；酶标仪、垂直电泳系统（美国BIO-RAD 公司）；MS3digital 型涡旋 振 荡 器（德 国IKA 公司）；5810R 型高速离心机（德国Eppendorf公司）；ABI 7500 PCR 扩增仪（美国Applied biosystems 公司）。

2 实验方法

2.1 供试液的制备 分别称取巴戟天不同饮片，用10 倍量水浸泡30 min 后，煎煮30 min，过滤后再加5 倍量水煎煮30 min，合并煎煮液，减压浓缩，1 000 r／min 离心5 min，去沉淀，得浓度为0.2 g／mL（生药重／药液体积，下同）药液，取部分稀释成0.1 g／mL 和0.5 g／mL 浓度的药液，低温保存备用［6］。

2.2 动物分组及给药 将110 只大鼠随机分为空白对照组、苯巴比妥0.1 g／kg 剂量组和生／制／盐巴戟天2.0、1.0、0.5 g／kg 剂量组，连续予相应剂量的药液灌胃给药7 d（空白对照组给予等量蒸馏水）。

2.3 肝微粒体制备 大鼠连续给药7 d 后，用乌拉坦（50% w／v，每只约0.6 mL）腹腔注射麻醉，用冰冷的肝脏冲洗液从肝门静脉在体冲洗肝脏至土黄色，剪取同部位肝脏组织（5.0±0.5） g 置于冲洗液中，在4 ℃冷库将其切碎，用冰冷的匀浆缓冲液匀浆。 匀浆液10 400 r／min 离心15 min；取上层溶液35 000 r／min 离心1 h，得肝微粒体。 所得肝微粒体均匀混悬于250 mmol／mL 蔗糖中，置于-80 ℃保存备用［7］。 肝微粒体总蛋白浓度采用考马斯亮蓝法进行测定。

2.4 Ⅰ相代谢反应体系及分析 在450 μL KPI 溶液中分别加入25 μL Solution A、5 μL Solution B 和10 μL 肝微粒体悬液，37 ℃、150 r／min 下水浴摇床预孵育5 min，再加入10 μL 睾酮（4、10、30 μmol／L）继续孵育7／15 min，取出后立即冰浴并加入4 mL 冰冷二氯甲烷终止反应， 加入10 μL 的2 mmol／L 吉非贝齐作为内标，3 000 r／min 涡旋8 min 后，1 000 r／min 离心15 min，取下层液3.5 mL，置于真空干燥箱中干燥后-20 ℃保存。 分析时加入100 μL 乙腈涡旋3 min，再加入100 μL 超纯水涡旋3 min，13 000 r／min 离心30 min，取上清液10 μL，UPLC 进样分析，代谢速率以6β-羟基睾酮的生成量进行计算［8］。

2.5 色谱条件 色谱系统：Agilent 1290 Infinity UPLC System，Agilent RRHDSB-C18 色谱柱（3.0 mm×100 mm，1.8 m），流动相A 乙腈，流动相B 水（0～2.5 min，70%～10% B；2.5～4 min，10%～50% B；4～5 min，50%～70% B；5～6 min，70% B），流速0.4 mL／min，柱温40 ℃，检测波长235 nm，洗脱时间6 min，进样体积10 μL。

2.6 Western blot 实验 取10 μg 肝微粒体蛋白，用10% SDS-PAGE 分离后转印到PVDF 膜，再用含有5%脱脂牛奶的TBST 封闭2 h。 漂洗后将膜与CYP3A 一抗（1∶3 000）置于4 ℃孵育过夜，用TBST清洗膜3 次，每次5 min，加入二抗（1∶1 000）室温孵育1 h。 采用ECL 试剂使膜发光，并通过Quantity One（Bio-Rad）对蛋白条带进行荧光定量，结果采用灰度值进行分析。

2.7 PCR 实验 肝脏组织中总RNA 采用TRIzol提取法进行提取，反转录试剂盒反转录cDNA，于PCR 扩增仪进行扩增和检测。 扩增中所需CYP3A引物按照文献［9］进行设计，CYP3A1：forward primer 5′-GGAAATTCGATGTGGAGTGC-3′，reverse primer 3′-AGGTTTGCCTTTCTCTTGCC-5′；CYP3A2：forward primer 5′-AGTAGTGACGATTCCAACATAT-3′，reverse primer 3′-TCAGAGGTATCTGTGTTTCCT-5′；GAPDH：forward primer 5′-CTGTGGTCATGAGCCCC TCC-3′，reverse primer 3′-CGCTGGTGCTGAGTATG TCG-5′。 结果采用2-ΔΔCT值进行分析。

2.8 统计学方法 采用SPSS 16.0 软件进行数据分析。 计量资料符合正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 巴戟天不同炮制品对CYP3A 酶活性的影响见表1。

表1 巴戟天不同炮制品对大鼠肝微粒体Ⅰ相代谢体系中6β-羟基睾酮生成速率影响的比较（±s，n＝3）nmol／（mg·min）

表1 巴戟天不同炮制品对大鼠肝微粒体Ⅰ相代谢体系中6β-羟基睾酮生成速率影响的比较（±s，n＝3）nmol／（mg·min）

注：与空白对照组比较，1） P＜0.05；与相应剂量及底物浓度的生巴戟天组比较，2） P＜0.05。

组别空白对照组苯巴比妥组生巴戟天组制巴戟天组盐巴戟天组剂量／（g／kg）—0.1 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 4 μmol／L 1.52±0.02 2.49±0.451）2.32±0.311）2.46±0.581）1.70±0.11 2.57±0.091）2.67±0.311）3.40±0.201）2）2.48±0.141）3.31±0.231）2）2.59±0.171）2）睾酮浓度10 μmol／L 2.23±0.13 3.68±0.101）3.29±0.221）3.28±0.181）2.38±0.16 3.58±0.121）3.75±0.441）2）5.01±0.391）2）3.62±0.081）5.02±0.221）2）3.96±0.161）2）30 μmol／L 3.07±0.12 5.38±0.161）4.54±0.171）4.74±0.551）3.37±0.16 4.95±0.371）4.62±0.831）7.26±0.281）2）4.48±0.181）6.59±0.371）2）5.40±0.501）2）

3.2 巴戟天不同炮制品对CYP3A 酶蛋白和mRNA表达的影响 见表2。

4 讨 论

P450 酶的被诱导或抑制与药物间产生的代谢性相互作用密切相关，当P450 酶被抑制时会导致共服药物代谢减慢，血药浓度出现不可预期的升高，引发副作用甚至引起严重不良反应，当被诱导时又可导致共服药物代谢加快而使药效降低。 P450 蛋白和mRNA 表达水平的变化是引起酶活性变化的主要机制。 在大鼠肝脏中CYP3A 主要包括CYP3A1、CYP3A2 和CYP3A23 等 亚 型，其 中CYP3A1 和CYP3A2是最主要的亚型，参与多数临床用药的代谢过程［1-2，10］。

表2 巴戟天不同炮制品对大鼠肝微粒体CYP3A 蛋白和肝组织CYP3A mRNA 表达水平影响的比较（±s，n＝3）

表2 巴戟天不同炮制品对大鼠肝微粒体CYP3A 蛋白和肝组织CYP3A mRNA 表达水平影响的比较（±s，n＝3）

注：与空白对照组比较，1） P＜0.05；与相应剂量及底物浓度的生巴戟天组比较，2） P＜0.05。

组别空白对照组苯巴比妥组生巴戟天组制巴戟天组盐巴戟天组剂量／（g／kg）—0.1 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0蛋白表达水平1.00±0.00 3.44±0.121）3.15±0.081）3.57±0.581）2.30±0.041）2.19±0.351）1.94±0.172）2.66±0.171）2.30±0.361）2.57±0.881）4.03±1.591）2）mRNA 表达水平CYP3A1 1.00±0.00 3.82±0.211）3.14±0.081）3.57±0.561）2.31±0.041）2.30±0.361）2.57±0.881）4.03±1.591）2）2.19±0.351）1.94±0.172）2.66±0.211）CYP3A2 1.00±0.00 2.98±0.091）2.20±0.021）1.69±0.01 1.96±0.011）2.11±0.081）2.11±0.031）2）2.11±0.021）2.14±0.081）3.29±1.141）2.15±0.931）

中药在采用药汁或辅料炮制后可能会产生对P450 增强或减弱的作用，从而改变组方用药后的效果，同时也可能会导致自身某些成分代谢的加快或减慢而改变药理作用。 巴戟天主要含有水晶兰苷等环烯醚萜类、甲基异茜草素等蒽醌类和巴戟天多糖及挥发油等，通过盐和甘草汁制后环烯醚萜类和蒽醌类等成分都会发生变化，进而导致生、盐、制巴戟天功效发生变化［11-15］。

本文研究结果表明，生巴戟天在《中国药典》规定的3～10 g（人用量，下同）剂量范围内对大鼠肝药酶CYP3A 活性有诱导作用，当达到20 g 的剂量时对CYP3A 不具有诱导作用，而制巴戟天和盐巴戟天在5 g、10 g 和20 g 的剂量下对CYP3A 均有诱导作用，其中制巴戟天随着剂量的增加诱导作用增强，而盐巴戟天在10 g 剂量下的诱导作用最强。 生巴戟天经过甘草汁制后， 在5 g 和10 g 剂量下对CYP3A的诱导作用未发生明显变化，在20 g 的剂量下诱导作用明显增强；经用盐炮制后，在5 g 剂量下诱导作用也未发生明显变化，在10 g 和20 g 的剂量下诱导作用明显增强。 巴戟天各种炮制品均可诱导CYP3A 蛋白和CYP3A1、CYP3A2 mRNA 的表达增加。

以上结果说明巴戟天在炮制前后对CYP3A 均有一定的诱导作用，用甘草汁和盐炮制后诱导作用进一步增强，尤其是甘草汁制巴戟天随着用药量的增加，诱导作用也随之增强，主要机理可能与其可诱导CYP3A 蛋白及CYP3A1、CYP3A2 mRNA 的表达增加有关。 炮制后诱导作用的增强将会进一步加速某些成分在体内的代谢，巴戟天炮制后抗炎镇痛、祛风湿作用减弱，而补肾助阳作用突显，这可能与相关成分的代谢增加有一定的关系。 由于中药成分体系的复杂性，还需要进一步明确巴戟天不同功效的主要物质基础及其体内过程等相关内容，才能更进一步地揭示巴戟天采用盐和甘草汁炮制的机理。