颈椎病实验动物模型的研究进展

蔡明媚，陈 斌，傅玉双，林安阳，修忠标，洪振丰，赵红佳

（福建中医药大学附属人民医院，福建 福州350004）

颈椎病又称颈椎综合征， 是颈椎骨关节炎、增生性颈椎炎、颈神经根综合征、颈椎间盘脱出症的总称， 是一种以退行性病理改变为基础的疾患［1］。长期的伏案工作、不良的坐姿或睡姿、不适当的体育锻炼、颈椎的退行性变、长期劳损等都可以作为颈椎病的发病因素。 颈椎病可大致分为颈型颈椎病、神经根型颈椎病、脊髓型颈椎病、交感神经型颈椎病和椎动脉型颈椎病等［2］。 近年来社会经济基础的持续性发展、人类生活习惯的变化以及工作负担的加重促使颈椎病的发生发展呈现年轻化的倾向，关于颈椎病的诊治也在逐步引起重视。 许多专家学者为探讨颈椎病的临床治疗疗效，建立了大量的动物模型进行实验研究，本文就近年来颈椎病相关实验常用的动物模型综述如下。

1 实验动物的选择

为了建造模型拟合度良好且可行性较高的颈椎病动物模型，以便于更准确、有效地研究颈椎病，选择动物造模时常需符合以下条件： ①选用的造模动物其生理结构和功能应尽量接近人类； ②对动物进行造模后引起的颈椎病病变应尽可能满足人体颈椎病发病的客观规律；③造模方法经济有效，操作过程简单易行；④模型的重复使用率好，存活率高。按亲缘关系来探讨，猿、猴等高等动物与人类关系最近，其在结构及功能层面上也是最理想的造模动物，但是从饲养条件、伦理道德问题和相对较长的建模周期方面综合考虑，一般较少用于实验研究；猪、羊、犬等动物由于体型较大，有驯养场地、费用等限制，无法进行大样本的实验研究，在动物实验中较少使用；兔、鼠之类的小型动物尽管不如大型动物的实验操作准确、方便，但从实验材料、成本、场所及训养条件等角度综合考虑，实验可行性更高，且有利于长期观察。 因此目前最常用的颈椎病造模动物是兔和鼠。

2 颈椎病分型造模方法

2.1 颈型颈椎病 颈型颈椎病是颈椎病发病初期的临床类型，初起病情较轻，若迁延失治、误治则容易进一步加重，转变为具有器质性改变的颈椎病。WANG 等［3］根据颈型颈椎病发病的致病因素，将家兔分为轻、中、重度刺激组置于风力6 级、温度5 ℃左右、湿度100%的空间，模拟自然界风、寒、湿刺激以制备风寒湿痹型颈型颈椎病动物模型，每日持续4 h，分别历时32、64、128 h。张欣等［4］结合屈颈过度及风、寒、湿致病因素建立无创兔颈型颈椎病模型，将大白兔固定于改良后的兔盒中迫使兔的颈部成45°低头屈曲位，完全显露兔颈部，剪除周围毛发，将保湿冰袋敷于其上，使吹风机出风口对准兔颈部且保持风力5 级，持续2 h，每日重复2 次，共造模28 d。 张圆芳等［5］按照张欣等建模方法将造模时间改良为每日1 次，持续造模5 h，总共历时56 d 以建造寒湿型兔颈型颈椎病动物模型，通过颈椎间盘组织形态学HE 染色观察发现颈椎间盘髓核及纤维环发生改变且出现大量炎症细胞。 唐学等［6］采用复合病因造模法即在张欣等造模基础上改兔的颈部成低头屈曲位60°，并延长造模时间为10 周，光镜下观察发现软骨细胞变性消失、胶原纤维结构发生破坏。 刘福水等［7］亦采用此法迫使家兔保持低头屈曲45°，每次5 h，每日1 次，持续12 周来建立颈型颈椎病模型进行实验研究。 目前所采用的颈型颈椎病动物造模方法多以白兔长时间低头屈曲为基础进行改良，这类实验模仿长期伏案工作、学习及长时间待在低温空调房的人群， 通过检测相关指标，证实坐卧姿势不规范、生活习惯欠佳、机体持久劳损是颈型颈椎病发病的主要原因。

2.2 神经根型颈椎病 神经根型颈椎病的临床发病率在50%～60%，是最常见的颈椎病类型，该病主要是由于骨质增生、颈椎间盘退行性改变造成颈神经根压迫，引发颈、肩部麻木疼痛及功能障碍［8］。构建理想的动物模型是研究该类颈椎病的前提，对临床治疗此类颈椎病有着重大意义。

2.2.1 椎管插线法 SUN 等［9］采用椎管插线法对大鼠颈脊髓神经根造成持续性的挤压以建立大鼠神经根型颈椎病模型，操作方法：大鼠麻醉、固定，剃净颈部及背部周围毛发，常规消毒，在颈部C4～T1区作一约3.5 cm 的中线切口，逐层分离皮下组织及颈后部肌群以充分显露C4～C6椎板，刮净表面附着物，切除C5～C6及C6～C7的黄韧带，去除C6椎板的骨膜，在C6椎板下植入长15 mm、直径0.5 mm的尼龙渔线，逐层闭合、缝合伤口，预防感染。 粟胜勇等［10］亦采用此法，在充分显露C6～T2椎弓板并清除周围组织的基础上，暴露脊髓，执显微外科镊将灭菌渔线沿脊髓纵向插入至C6、C7、T1神经根腋下。此造模方法造模后大鼠周围神经异常症状出现较快，但因尼龙渔线压迫力度较弱，导致症状持续性差，故此法较适用于急性期神经根型颈椎病的研究。

2.2.2 单纯机械性压迫 张忠亮等［11］采用将消毒灭菌的硅胶片直接压迫颈神经根，成功建造神经根型颈椎病动物模型，操作方法：大鼠麻醉、固定，剃毛、消毒后沿C7棘突向上取颈部正中约4 cm 长切口，使C6椎板充分显露，执止血钳咬除部分椎板及关节突，暴露神经根，将消毒灭菌的硅胶片轻置于C6神经根与硬膜囊交界处的下腋侧， 缝合包扎伤口，造模完毕。 SMITH 等［12］亦根据单纯性机械刺激颈神经根的造模方法， 通过剥离麻醉后大鼠C6、C7椎旁肌肉，咬除C6、C7部分椎板及关节突，充分显露C7神经根，后用10 gf 微血管夹压迫神经根15 min，术后采用测量大鼠同侧前爪掌面对机械性刺激的痛觉敏感程度来评价该模型的可靠性。 LIU 等［13］则采用不锈钢柱插入锥间孔中造成持续性压迫来建立神经根型颈椎病模型，从而探讨其疼痛机制。

2.2.3 机械性压迫与炎症刺激协同 金哲峰等［14］通过采用持续性机械性压迫和炎性刺激大鼠，模拟慢性颈椎间盘及关节的双重退变，以此建立神经根型颈椎病动物模型，并通过行为学、影像学、电生理学等证实该模型建造的实验意义。 操作方法：大鼠麻醉、固定，剃除颈背部周围毛发，常规消毒，于颈正中线取一4 cm 长切口，逐层切开皮肤、皮下组织及脊柱旁肌肉，使两侧关节突关节充分显露，用34号钝圆针头接通输液泵以4 μL／min 的速度依次注入胶原蛋白酶（每个关节注入5 μL）至C5／C6、C6／C7关节突关节，注入完毕，切除颈骼肋肌与半头棘肌，再依次切断颈背部深肌群颈夹肌及头、颈、寰最长肌及C2～C7棘上和棘间韧带，无菌闭合伤口，予青霉素抗感染。田园等［15］用浸有甲醛的定量滤纸片压迫并刺激大鼠C7神经根，模仿炎症性神经根型颈椎病的发病机制进行实验模型建造。 此类模型运用了药物介导与机械压迫刺激手段进行建立，手术操作过程简单、安全，且造模成功的实验动物存活率较高。

2.3 脊髓型颈椎病 脊髓型颈椎病是由于颈椎结构的退行性改变导致椎管狭窄、脊髓慢性压迫与功能障碍，进而引发相应的临床症状，可使脊髓功能发生损伤，甚者导致肢体残疾［16］。

2.3.1 螺钉压迫法 螺钉压迫法是于颈前路或颈后路置入螺钉，进行长时间压迫动物颈脊髓以建立脊髓型颈椎病动物模型。 施立奇等［17］通过C2后路螺钉压迫法建立脊髓损伤模型： 家兔常规消毒麻醉，取C2后侧入路，于棘突正中执咬骨钳咬一“V”型骨缺损，先使用自攻螺钉于缺口处向椎板攻丝，然后改用平头螺钉缓慢拧入造成压迫。赵玲等［18］采用骨水泥压迫钉置入颈前路C3椎体前方， 持续挤压颈脊髓以模拟人脊髓型颈椎病发病机理。 此类造模方法操作过程相对简单易行， 模型重复性良好，但是造模过程容易引发实验动物死亡。

2.3.2 球囊压迫法 此法是在实验动物椎管内置入可控压力的球囊，随压力的逐渐增大对脊髓产生进行性压迫，进而模拟脊髓型颈椎病患者的发病过程。 沈宝良等［19］选用山羊为模型动物，使用球囊压迫装置经颈椎前路手术将其固定在C3椎体内，术后通过外置注射器向球囊内注入0.1 mL 碘海醇造影剂，1 周1 次，持续12 周，以此建立山羊脊髓型颈椎病模型。 此类造模方法多适用于犬、羊、猪等大型动物，死亡率较低。

2.3.3 植入法 杨宇等［20］采用大鼠自体骨植入法建造脊髓型颈椎病动物模型：暴露大鼠颈椎骨面，自C7基底部离断棘突，取出并清除表面组织置于一旁备用；咬除C5或C6部分椎板，继而取备好的、大小相应的骨块植入椎间隙，向椎管内尽量嵌压直到大鼠上肢出现反射性抽动，术毕肌注青霉素预防感 染。 YOSHIZUMI 等［21］在 其 慢 性 颈 脊 髓 压 迫 模 型中通过在大鼠的C5～C6椎板下植入聚氨酯薄板，使其通过吸水逐渐膨胀以实现迟发性压迫性脊髓型颈椎病的发生。 除上述植入物外，还有采用植入硅胶颗粒［22］、缓 慢 膨 胀 型 橡 胶［23］、聚 乙 烯 醇 丙 烯 酰 胺互穿网络水凝胶［24］等进行脊髓型颈椎病的造模。

2.3.4 注射法 戎利民等［25］在X 线指引下经短毛豚鼠颈椎前路于C4～C5或C5～C6间隙距离椎体后缘5 mm 处插入4 号空针， 深度约2～3 mm， 注入0.1 mL 重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）／载体（PVP）复合物，对颈脊髓造成慢性持续性压迫，术后8 周观察发现短毛豚鼠颈脊髓受压变形符合脊髓型颈椎病的椎体改变。杨家祥等［26］亦采用类似的造模方法，在大鼠颈椎间隙后缘注入重组人骨形态发生蛋白与载体的复合制剂， 持续性挤压颈段脊髓，使椎间盘逐渐发生退变。

2.3.5 体外遥控压迫装置 李梓赫等［27］认为传统的慢性脊髓压迫模型存在手术创伤、感染风险大及可控性差等问题，为此，他们采用一种通过体外蓝牙调控体内椎间压力的装置来建立慢性颈脊髓压迫模型。 将成年小尾寒羊麻醉固定后，经其颈前路在X 线确认下切除C2／C3椎间盘直至椎体后缘，刮除椎体两侧终板， 该缺损与压迫装置大致等同，于椎间隙缺损处置入压迫装置，固定并将推杆头部置于椎体后缘，之后将体内控制模块埋入皮下，术后每2 天推进压迫装置一次，每次推进0.1 mm，定期观察发现成年小尾寒羊的颈脊髓发生损坏。 体外遥控压迫装置是脊髓型颈椎病造模的一种新尝试，具有可控性好、可重复性高的优点，且建模过程只需手术操作1 次，造模费用低，可大范围推广应用。

2.4 椎动脉型颈椎病 椎动脉型颈椎病是由于颈椎发生退行性改变，导致椎动脉血流障碍，进而引起脑供血不足的一种颈椎病类型，临床上约70%的颈椎病发病伴有椎动脉受累的表现［28］。因此对该类颈椎病的治疗研究同样至关紧要，而良好的实验动物模型的建立必不可少。

2.4.1 注射组织硬化剂法 WANG 等［29］使用10 mL硬化剂消痔灵注射于家兔左侧C3～C5颈椎横突侧面，第2 周和第4 周各重复1 次。 造模结束后用激光多普勒测量仪测定家兔颈椎动脉血流量，结果显示造模家兔的椎动脉血流量明显减少，说明该模型成立。 此项造模方法简单、有效，是现今椎动脉型颈椎病应用相对广泛的模型构建方法。

2.4.2 植骨压迫法 宋敏等［30］将大鼠经腹腔麻醉后，于其颈背部取一正中纵形切口，充分开放右侧颈部肌肉，暴露C5、C6椎体及横突，切除横突骨翼，缓慢分离椎动脉内侧骨膜直到椎体后方，后将骨块植入骨膜下间隙，逐层缝合，止血包扎。 最终通过检测大鼠焦虑抑郁度、神经精神紧张度以及学习记忆能力等验证植骨压迫法建造椎动脉型颈椎病的模型具有统计学意义。

2.4.3 瘀血阻络法 该法是直接取同种异体动物的血液制成瘀血直接注入模型动物的颈夹肌及头夹肌内，使其瘀血阻络，引发一系列椎动脉型颈椎病的症状表现。 LIU 等［31］在前人研究的基础上使用直接诱发造模法复制椎动脉型颈椎病动物模型，取25%的生理盐水与同种属异体家兔的耳正中动脉血等比混合，往家兔一侧颈夹肌、横突间肌及横突棘肌的肌内与肌间隙分别注入，共注射9 mL，在注射前及注射后2 周进行彩色超色检测，发现该侧椎动脉血流速度明显减小，表明造模有效。

2.4.4 力学平衡失调 在模拟椎间盘病变造成的椎动脉型颈椎病时，SUN 等［32］根据动静力平衡失调原理，将麻醉大鼠固定、消毒，于颈背部正中取一切口，依次切断颈阔肌、头颈寰最长肌、颈髂肋肌及头半棘肌，并同时剪断C2～C7椎体棘上韧带和棘间韧带，造成颈椎力学平衡失调。 逐层缝合伤口，3 个月后处死大鼠取其C4／C5、C5／C6椎间盘，经苏木精和伊红染色制成切片在光镜下观察发现造模后大鼠颈椎间盘形态发生改变，出现纤维环紊乱、髓核萎缩，说明此造模方法具有实验意义。 YIN 等［33］亦采用此法来建立大鼠动静力失衡的椎动脉型颈椎病模型， 其造模方法中除切断上述肌群及韧带外，还同时切断颈斜方肌、菱形肌、浅层及深部肌肉，且分别切除1.5 cm 以防止愈合，数月后通过免疫组织化学观察发现大鼠颈椎间盘出现退行性改变，说明模型成立。

2.4.5 椎动脉结扎法 此法是指通过对一侧椎动脉进行离断、夹闭或结扎使该侧椎动脉供血不足，最终形成椎动脉型颈椎病。郭帅等［34］在家兔胸骨颈静脉切迹上方作一横型切口，寻找并分离右侧臂丛神经，进而找到右侧椎动脉第一段，将其分离，按照先近心端、后远心端的顺序进行缝线结扎，然后在结扎部位离断椎动脉，缝合包扎。 通过免疫组织化学染色观察及qRT-PCR 结果分析此种方法造模成功率达93%以上。

2.4.6 混合法 混合法即是上述2 种或多种造模方法结合形成，目前应用造模效果良好。 如李清林等［35］在其实验研究中将一侧力学平衡失调法与对侧骨膜下植骨压迫法相结合，通过切除大鼠左侧颈阔肌、颈斜方肌、颈部夹肌、头颈菱形肌、最长肌、颈髂肋肌、半棘肌，以及切断颈阔肌、头颈寰最长肌等造成大鼠左侧肌力失衡， 同时分离对侧C5、C6椎体前颈长肌，将骨块植入已经分离的椎动脉骨膜下间隙，造成持续压迫，造模结束后通过旷场实验观察造模后大鼠站立次数、运动距离、修饰次数等均显著减少，表明造模成功。 贾力莉等［36］在研究芪葛止眩颗粒对椎动脉型颈椎病的疗效时，采用动力平衡失调法合并注射硬化剂法来复制模型，在常规切除颈部部分肌肉组织造成左侧颈部动力失衡的基础上，于术后第2 周、第4 周在左横突侧面分别注入消痔灵注射液2 mL、1 mL，通过拍摄颈椎X 线片及检测椎基底动脉血流、血液流变学验证椎动脉型颈椎病模型是否成模。 现如今对椎动脉型颈椎病的研究与时俱进，造模方法也日益成熟，混合造模法的模型复制成功率也逐渐升高。

3 总 结

现今面临着时代进步带来的压力和挑战，人类罹患颈椎病的年龄逐渐趋向年轻化，对于颈椎病治疗的研究显得越发重要。 出于伦理道德方面的考虑， 实验通常建立动物模型来模拟人颈椎病的发生、发展，探讨该病的预防与治疗。 当前采用实验性诱发、复制颈椎病动物模型的方法多种多样，已经能基本模拟各种类型颈椎病的病因及发病机制，满足实验要求，但总结当前已经报道的各种颈椎病动物模型，仍可发现尚具有以下不足：①造模方法单一，缺乏综合模拟模型：目前实验中的造模方式多以单一动物或单一操作方法为主，虽然造模过程较为简单易行，但尚不能实现颈椎病发展过程中呈现的复杂性、全面性及不可控性；②造模时间较长：总结发现近年报道的颈椎病动物造模时间多为每天4～6 h，持续2～3 月，造模周期仍较长；③动物存活率偏低：手术创伤、术后感染、造模动物焦躁不安等因素仍持续影响造模动物的存活率；④缺乏颈椎病中医证候动物模型的制备：现阶段中医对颈椎病的治疗疗效显著，中医治疗得到患者的满意与推崇，但实验对研究中医证候分型方面的颈椎病模型制备方法仍较缺乏，不能为中医药治疗颈椎病提供充分有效的科学研究依据。 因此，对颈椎病动物模型的创立可向更深、更全面的层次发展，从颈椎病多种复杂病因、发病机制、生理病理结构扩展到研究分子生物学、力学及中医证候表现等方面，建立公认的可行性佳、重复率高、综合模拟性高的颈椎病动物模型，充分研究和发挥中医药与现代医学相结合的优势与展望。