利用CNV-seq技术产前诊断Pallister-Killian综合征胎儿一例

冯暄，张庆华，张钏，郝胜菊，郑雷，王兴

Pallister-Killian综合征（Pallister-Killian syndrome，PKS，OMIM 601803）的临床表现包括特征性颅面畸形、先天性心脏缺损、膈疝、低张力、癫痫和皮肤色素异常。1977年，Pallister等[1]在成人中首次描述了这种病。虽然发病率尚不清楚，但医学文献中已经报道了100多例PKS，随着产妇年龄的增加，PKS的发病率也随之增加[2]。PKS的细胞遗传学特点是特定组织中以嵌合体形式存在的12号短臂等臂染色体，故也称为等臂12p综合征或12p四体综合征。这些异常细胞由4个12号短臂染色体组成，而不是正常存在的2个染色体。12p四体的嵌合效应是由于额外染色体上携带的基因，最终导致颅面部、心血管、肾脏和其他系统异常。

1 病例报告

孕妇27岁，孕2产1，否认近亲婚配，且无遗传病家族史。未做产前筛查，妊娠中期四维彩色超声提示：胎儿膈疝可能性大，主/肺动脉比例不协调。经过产科医生咨询，签署知情同意书后，于孕24周行羊水穿刺，抽取孕妇羊水30 mL，取其中10 mL用于高通量测序拷贝数变异测序（copy number variation sequencing，CNV-seq）检测。其余20 mL羊水分2管，经离心机（Eppendorf 5804R）2 000 r/min离心10 min后弃上清，取沉淀细胞，加适量羊水细胞培养基，接种于无菌培养瓶内，置于37℃、含5%CO2的培养箱中静置培养8～9 d，后进行消化、染色体制片、G显带及核型分析。以G显带染色制备染色体标本。按照人类细胞遗传学国际命名体制（2013）标准，计数20个中期分裂相，分析5个核型。胎儿羊水细胞染色体核型分析结果：47，XY，＋i（12）（p10）[58]/46,XX[42]，说明该样本为12号短臂等臂染色体的嵌合体，见图1。

图1 胎儿羊水培养染色体核型图

高通量测序CNV-seq法提取羊水基因组DNA，进行文库构建：通过片段化－连接、聚合酶链反应（PCR）前纯化、PCR扩增、PCR后纯化一系列过程，利用Next Seq CN500高通量测序平台行CNV-seq检测，并进行测序分析，测序结果经贝瑞基因Enliven®变异注释系统标注。CNV-seq结果提示：du p（12）（p13．33p11．1）（mos），提示该样本12号染色体p13.33-p11.1处检测到拷贝数为3.5、片段大小为34.70 Mb的嵌合重复区域，起始位置为chr12:160001-34860000，见图2，3。查阅Decipher数据库（Database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensemble resource）、在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、PubMed数据库和UCSC Genome Browser（University of California Santa Cruz），该变异包含了Pallister-Killian syndrome（PKS）[OMIM:601803]的全部区域。数据库显示，PKS患者主要表现为不同程度的智力障碍和发育迟缓，特殊面容，毛发稀疏，皮肤着色异常，耳聋，癫痫，脊柱侧弯，先天性髋关节脱位，指/趾畸形，新生儿肌张力减退，膈疝，先天性心脏缺陷，肺部发育不良，肾脏发育不良，喂养困难，肠旋转不良，肛门异常，腹股沟疝，男性外生殖器异常等。结合羊水染色体核型分析与CNV-seq结果，该样本确诊为PKS。为明确变异来源，召回孕妇及其丈夫，进行外周血染色体核型分析。夫妻双方G显带核型结果均未见异常，见图4，说明胎儿的染色体异常为新发。

2 讨论

图2 孕妇及丈夫外周血染色体核型图

图3 胎儿CNV-seq检测12号染色体测序散点图

图4 胎儿cnv-seq检测12号染色体拷贝数变异图示

PKS可能涉及体内的任何器官系统。虽然没有可以作为PKS临床诊断的典型畸形表现，但依然存在着很明显的临床特征：①特殊面容，皮肤色素异常、粗犷面容、眼距宽、高腭弓、前额突出、短颈等；②神经系统：脑结构异常、癫痫、肌张力减退；③心脏缺陷：房间隔缺损；④肺部受累：肺发育不全、膈疝；⑤胃肠道表现可能包括肠旋转不良和肛门移位；⑥骨骼肌肉系统发育异常，包括PKS特有的生长模式，即在宫内提示明显的生长过度现象，但在出生后立即表现为生长发育迟缓；75%的PKS患者还患有一定程度的视力损伤[3]。先天性膈疝被认为是PKS典型的特征，并且经常是出生后早期的死亡原因[4]。PKS在妊娠中期超声中可显示明显的畸形，常见的畸形包括：羊水过多、膈疝、中枢神经系统异常、胎儿水肿、颜面部异常、心室扩张、短肢畸形；当超声提示羊水过多、膈疝、肢根骨短小，尤其伴有生长过度时，尤其应考虑本病[5]。本病例中的孕妇，妊娠中期系统超声提示：胎儿先天性膈疝，股骨、肱骨位于平均值的2个标准差以下、心脏移位至右侧胸腔、肺/主动脉比值增大、心包积液、三尖瓣返流（少量）。符合PKS超声指标的主要特征。

PKS是一种散发的，罕见的染色体疾病，具有复杂的临床表型及特殊的遗传学特点，临床上往往容易漏诊，所以准确有效的产前诊断，是避免缺陷患儿出生、减轻患儿家庭和社会负担的最佳手段。在产前诊断中，超声检查对PKS的诊断具有重要价值，当碰到羊水过大、先天性膈疝、四肢短小、过度发育的胎儿应该高度警惕，随着三维超声技术的发展，胎儿面部特点的三维成像也能为PKS产前诊断提供更多的信息；当在临床中遇到特征性的粗犷面容（大前额、头发稀疏、眼间距增宽、短鼻且鼻孔前倾、鼻梁低平、人中长、颈短），重度发育迟缓、皮肤色素异常等症状时，临床医师可提出初步判断，并且应注意不同组织来源标本的特点，并结合多种检测技术进行诊断。尽管PKS真实的发病率不能确定，但其是一种很罕见的遗传病，因为症状相对较轻的此病患儿可能会被人们忽视，所以某些患者事实上并未在医院留有确诊记录。因此，被确诊的病例仅仅是此病症状相对严重的一些患儿。在已有的医学文献记录中，仅有150多例PKS的确诊病例。正是由于PKS具有特殊的细胞遗传学特点，即异常的染色体有组织特异性，在临床中诊断可能常会被遗漏，所以遗传咨询就显得更为重要。特别是对已经生过PKS患儿的家庭，产前诊断与遗传咨询是杜绝此类患儿再次出生的唯一手段。首先，从遗传模式来讲，PKS不具有遗传性。诱发此病的染色体变异一般是属于父源或母源生殖细胞（精子或卵子）形成过程中发生的不确定事件。通常患者其他家庭成员都并没有此病症的患病史。细胞分裂中的反常现象，医学上常称其为黏合现象，很可能会在某个生殖细胞中产生多余的12号短臂等臂染色体。如果此反常的生殖细胞影响到了下一代体内细胞的基因组合，那么该新生儿体内细胞可能会兼有12号染色体的两份正常拷贝和多余的12号短臂等臂染色体。在胎儿的早期发育过程中，其体内某些细胞内并没有多余的父源或母源12号短臂等臂染色体，而另一些细胞内却有。此遗传现象在医学上被称为染色体嵌合。几乎所有的PKS都是由于此染色体嵌合现象引发的。如果所有的机体细胞里都有此多余的等臂染色体的话，那么引发的PKS症状的严重程度会使患者的生存质量大为降低。

随着二胎政策的全面放开，高龄孕妇不断增加，现行产前诊断技术核型分析不能满足临床产前诊断需求，鉴于CNV-seq在临床的不断实践，其凭借着检测范围广、精准、通量高、成本低、操作简便等优势，在产前诊断中的应用逐步深入。2019年4月10日，国内首个《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》（简称《共识》）在《中华医学遗传学》上刊发。《共识》对CNV-seq技术在产前诊断中的应用规范进行了详细的阐述说明，对规范CNV-seq技术的临床应用，推动技术发展起到了非常重要的作用。本病例用CNV-seq技术在产前明确诊断出PKS，也进一步证实了CNV-seq技术作为一线技术应用在临床的效果，真实有效地评价了该技术的诊断水平。

本病例妊娠中期超声提示先天性膈疝、股骨短等异常，进行产前诊断。运用染色体G显带核型分析和CNV-seq技术检测。羊水核型最初发现该样本核型以嵌合形式存在1条额外标记染色体，核型结果为47，X Y，+mar[58]/46，X Y[42]。与CNV-seq结果核对之后，可以明确这条额外标记染色体的来源为12号染色体短臂，最终确定了羊水核型分析结果：47，X Y，+i（12）（p10）[58]/46，X Y[42]。这也证明了CNV-seq技术可以鉴别来源不明的胎儿标记染色体，明确其遗传物质的来源，对染色体微缺失/微重复综合征的诊断有重要价值。PKS患者异常的染色体有组织特异性，通常在皮肤成纤维细胞中可以检测到异常。因此，由于PKS这种特殊的组织特异性，PKS的诊断可能经常被遗漏，并且通常在快速分裂的细胞，如外周血淋巴细胞中未检测到[6-7]。现已报道的病例中几乎没有在外周淋巴细胞中诊断出异染色体i（12）（p10）的报道[8]。据不同组织中期染色体核型分析统计，包含异常染色体i（12）（p10）的组织中，淋巴细胞检出率为0～2%，成纤维细胞检出率为50%～100%，羊水细胞和骨髓细胞检出率为100%[9]。本病例羊水细胞中i（12）（p10）占58%，羊水CNV-seq结果示12号染色体短臂重复，拷贝数为3.5，一般来说，单纯的染色体重复，检测到的拷贝数应为3，但该样本是12号短臂等臂四倍体的嵌合体，导致其拷贝数为3.5。说明CNV-seq技术可以精准地检测出比例高于5%的嵌合体。综上所述，G显带核型分析与CNV-seq技术联合应用，可以明确诊断PKS。