丹参川芎嗪对糖尿病大鼠神经病理性疼痛的改善效果观察

陈波，刘文雄

西安市西电集团医院，西安710077

神经病理性疼痛是糖尿病最为常见且危害最为严重的慢性并发症之一，主要表现为周围神经感觉(触觉和痛觉)及自主神经异常[1,2]。在我国，约有近50%的糖尿病患者存在糖尿病神经病理性疼痛，且发病率随糖尿病患病时间延长而增加[3]。目前，临床常用的治疗糖尿病神经病理性疼痛的药物主要包括抗惊厥药物(如加巴喷丁、普瑞巴林等)、抗抑郁类药物(如阿米替林、帕罗西汀等)及离子通道阻断药物，但这些药物对于糖尿病神经病理性疼痛的症状缓解效果不甚满意[4]。川芎嗪是中药川芎的主要有效成分，其药效报道最多的是对于心血管细胞的积极作用效果，具有保护心肌细胞、对抗心肌炎症反应、扩张血管、降低血液黏稠度等功效[5,6]。丹参素作为唇形科植物丹参干燥根/茎的有效成分，在冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛等心血管疾病领域有积极的治疗效果[7,8]。近年来出现了丹参川芎嗪注射液等复方制剂，其不仅在高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑供血不足、脑血栓等心脑血管疾病中有明显的治疗效果[9]，且有较好消炎镇痛效应[10]。丹参川芎嗪对神经病理性疼痛的治疗效果得到部分实验研究证实，但丹参川芎嗪能否缓解糖尿病神经病理性疼痛，目前尚未见系统的研究报道。2018年7月，我们通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建糖尿病大鼠模型，通过疼痛阈值、神经传导速率、重要细胞因子表达检测探究丹参川芎嗪对糖尿病大鼠神经病理性疼痛的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SPF级Sprague Dawley大鼠(3月龄)30只，体质量275 ～290 g，购于空军军医大学实验动物中心。链脲佐菌素(STZ)溶液购于美国Sigma公司；戊巴比妥钠溶液购于美国Sigma公司；丹参川芎嗪注射液购于吉林四长制药有限公司；便携式血糖测试分析仪购于美国Lifescan公司；Von Frey纤毛购于美国Stoelting公司；热痛敏刺激和测量系统购于意大利Commat公司。生物信号采集系统购于成都泰盟科技有限公司。cDNA反转录试剂盒购于北京天根生物技术公司；Maxima SYBR Green qPCR试剂盒购于美国Thermo Fisher公司；RNA提取试剂TRIzol购于美国Invitrogen公司。

1.2 动物模型构建和实验分组 实验室温度维持在23 ℃左右，湿度维持在50%，12 h昼/夜循环照明，动物自由饮水和进食。通过腹腔注射STZ溶液(55 mg/kg)的方式构建糖尿病大鼠模型，注射72 h后通过血糖测量仪检测各组大鼠随机血糖值，血糖值高于14.0 mmol/L且表现出多饮、多食、多尿特征的大鼠被认定为糖尿病建模成功。将30只大鼠随机分为3组，每组10只，包括空白对照组(Control组)、糖尿病组(DM组)及糖尿病协同丹参川芎嗪治疗组(DM+SML组)。于STZ注射的72 h后(造模鉴定成功)腹腔注射丹参川芎嗪注射液，剂量为2 mL/kg，每天注射1次，连续注射8周。

1.3 大鼠足底机械痛阈值测定 于糖尿病模型鉴定完毕的(STZ注射72 h后)第0、2、4、6、8周,分别测定各组大鼠的足底机械痛阈值。将大鼠置于树脂有机玻璃罩中，底部带有金属网，测试前大鼠适应该环境至少30 min。通过使用Von Frey纤维丝以自下而上的顺序刺激大鼠足底中部，使纤维发生弯曲，大鼠出现明显的缩足反应时计为阳性。重复该刺激动作，直至测量仪先后5次记录到类似的测试值(测试间隔不低于10 s)，取5次记录的平均值作为该只大鼠单侧足底的机械缩足反应阈值，每只大鼠均进行双侧足底测定。

1.4 大鼠足底热痛阈值的测定 于糖尿病模型鉴定完毕的(STZ注射72 h后)第0、2、4、6、8周，分别测定各组大鼠的足底热痛阈值。将实验大鼠置于有机玻璃笼中，测试前大鼠适应该环境至少30 min。使用热辐射测痛仪对动物足底中心位置进行热光束刺激，大鼠因难以耐受热痛出现抬足反应，此时光束会自动切断并自动记录反应时间。每只大鼠的每侧足底共刺激5次(双侧共10次)，每次间隔10 min，记录10次的测量值并取其平均值。

1.5 大鼠运动神经传导速率的测定 于糖尿病模型鉴定完毕的(STZ注射72 h后)第0、2、4、6、8周，分别测定各组大鼠的足底机械痛阈值。腹腔注射戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)对大鼠进行麻醉。将大鼠置于铺有辅助加热装置的实验台上。将两个刺激电极分别插入大鼠的踝关节和坐骨切迹上。待电极植入稳定后，对刺激电极通入电流，采用生物信号采集系统记录复合动作电位的潜伏期(神经传导时间)，同时测定记录电极和刺激电极间沿着神经走向的间隔距离，计算获得感觉神经的传导速率。

1.6 大鼠脊髓p38MAPK和IL-1β基因表达测定 于丹参川芎嗪治疗8周后，处死各组大鼠，通过RNA提取试剂盒提取大鼠腰段脊髓L5背角总RNA，随后按试剂盒说明书步骤进行逆转录反应，使用Bio-Rad CFX96对所选取的目标基因进行测定，使用GAPDH作为内参基因。p38MAPK正向引物：5′-TCCAAGGGCTACACCAAATC-3′，反向引物：5′-TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC-3′；IL-1β正向引物：5′-TGATGTTCCCATTAGACAGC-3′，反向引物：5′-GAGGTGCTGATGTACCAGTT-3′。使用2-ΔΔCT法对p38MAPK和IL-1β的相对表达量进行半定量分析。

2 结果

2.1 丹参川芎嗪对糖尿病神经病理性疼痛大鼠随机血糖的影响 见表1。

表1 三组不同时点随机血糖比较

注：与 Control组相比，*P<0.05。

2.2 丹参川芎嗪对糖尿病神经病理性疼痛大鼠足底机械痛阈值和热痛阈值的影响 见表2、3。

表2 三组不同时点足底机械痛阈值比较

注：与Control组相比，*P<0.05；与DM组相比，#P<0.05。

表3 三组不同时点足底热痛阈值比较

注：与Control组相比，*P<0.05；与DM组相比，#P<0.05。

2.3 丹参川芎嗪对糖尿病神经病理性疼痛大鼠运动神经传导速率的影响 见表4。

表4 三组不同时点运动神经传导速率比较

注：与Control组相比，*P<0.05；与DM组相比，#P<0.05。

2.4 丹参川芎嗪对糖尿病神经病理性疼痛大鼠脊髓p38MAPK和IL-1β基因表达的影响 Control组、 DM组、DM+SML组大鼠脊髓p38MAPK基因相对表达量分别为1.0±0.4、5.4±0.9、2.1±0.6，IL-1β基因相对表达量分别为1.0±0.4、3.9±0.8、1.8±0.8。与Control组相比，DM组大鼠的脊髓p38MAPK和IL-1β基因表达均升高(P均<0.01)。而DM+SML组大鼠脊髓p38MAPK和IL-1β基因表达低于DM组(P均<0.01)。

3 讨论

神经病理性疼痛作为糖尿病最为常见且危害最严重的并发症之一，严重影响糖尿病患者的生理和心理健康。糖尿病神经病理性疼痛的发生机制与长期慢性高血糖引发的代谢紊乱、微循环障碍、神经系统细胞炎症反应、氧化应激等因素相关[11]。目前临床应对糖尿病神经病理性疼痛主要措施是控制血糖配合镇痛、抗惊厥和抗抑郁药物，但治疗效果仍不佳。丹参川芎嗪已被证实具有降低血液黏度、改善微循环、扩张心脑血管、抗血小板聚集等功效，并已广泛用于心脑血管缺血、心肌梗死、脑血栓的治疗[9,12]。最新研究发现，丹参川芎嗪亦具有抗菌消炎及缓解神经病理性疼痛的作用[10]。

STZ能迅速破坏胰岛中的β细胞，从而显著降低β细胞介导的胰岛素分泌，引起机体血糖的持续升高和渐进的糖尿病症状。本研究中，我们通过腹腔注射STZ的方式构建糖尿病模型，结果发现，STZ注射后的72 h开始(第0周)，糖尿病大鼠即开始出现足底机械痛阈值和热痛阈值的显著降低，且糖尿病大鼠的足底机械痛阈值和热痛阈值在整个实验进程中一直维持较低水平。本实验结果与既往研究结果一致，提示STZ诱导的糖尿病大鼠出现与糖尿病患者类似的疼痛阈值降低的表征[13,14]。另外，我们发现丹参川芎嗪注射液从第2周开始表现出对足底机械痛阈值和热痛阈值的显著改善效果，并且该种改善效果随治疗时程的推进愈加显著。提示丹参川芎嗪对糖尿病机体的疼痛敏感性退化有显著改善效应。

糖尿病患者通常表现出周围神经的显著受损，而糖尿病患者的感觉神经异常通常早发于运动神经，下肢受累重于上肢，而临床通过使用运动神经传导功能检测来诊断发现糖尿病患者的周围神经病变[15]。本研究发现，STZ注射的大鼠表现出运动神经传导速率显著降低，进一步证实糖尿病大鼠表现出显著的神经病理性病变的相关症状。另外，我们发现丹参川芎嗪治疗2周即开始对糖尿病大鼠的运动神经传导速率产生显著的提升效果，且这种积极的治疗效果随治疗时程的推进愈加显著。进一步证实丹参川芎嗪对糖尿病神经病变的显著改善效应。

大量研究揭示，MAPKs信号通路在疼痛的发生发展中发挥重要作用，而近年来研究也发现，MAPKs信号同样介导糖尿病神经病理性疼痛的发生发展，糖尿病神经病理性疼痛与脊髓、脊髓背根神经节、坐骨神经节中的MAPKs过度激活密切相关[16]。而p38MAPK作为MAPKs中的重要亚型，在糖尿病神经病变中发挥重要作用。本实验结果发现，STZ注射的糖尿病大鼠脊髓中的p38MAPK同样呈现过表达状态。而丹参川芎嗪注射液治疗8周后，糖尿病大鼠的脊髓p38MAPK表达显著降低，其值接近Control组，此进一步揭示p38MAPK表达抑制可能在丹参川芎嗪缓解糖尿病神经病理性疼痛中发挥重要作用。另外，我们发现IL-1β在糖尿病大鼠脊髓中的表达高于对照，差异有统计学意义，揭示糖尿病大鼠的脊髓组织处于高炎性因子表达状态，丹参川芎嗪能显著抑制糖尿病大鼠脊髓组织中IL-1β表达，提示丹参川芎嗪对糖尿病神经病变的改善效果与其自身的抗炎性效应有关。

综上所述，丹参川芎嗪可有效改善糖尿病大鼠神经病理性疼痛的相关症状，提高足底机械痛阈值、热痛阈值及运动神经传导速率，抑制糖尿病大鼠脊髓组织中p38MAPK、IL-1β表达。