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硒纳米颗粒治疗类风湿关节炎大鼠效果观察及抗炎机制

2020-03-25任世祥赵潇雄陈彤周磊马德思温亮王志为林源张博

山东医药 2020年4期
关键词:类风湿关节炎机体

任世祥,赵潇雄,陈彤,周磊,马德思,温亮,王志为,林源,张博

首都医科大学附属北京朝阳医院,北京100020

类风湿关节炎是一种临床常见的自身免疫性疾病,患者早期临床表现为关节肿胀、行动不便等,若病情未及时得到控制,则患者很可能会出现关节强直甚至畸形,严重影响患者的身体健康及生活质量[1,2]。硒元素是一种机体正常运转必不可少的微量元素,缺少硒元素会导致机体重要器官的正常运转出现异常,从而导致多种疾病的发生[3]。有学者认为,类风湿关节炎症状发生是由于患者免疫功能下降,从而导致关节出现炎症反应。硒元素是一种强效的免疫调节剂,能作为一种非特异刺激因素对机体体液免疫及细胞免疫系统进行有效刺激,从而一定程度上增强患者免疫能力[4]。目前为止,国内外鲜有关于硒纳米颗粒干预类风湿关节炎症状的研究。2018年5月,我们构建类风湿关节炎大鼠模型,并使用硒纳米颗粒进行干预,旨在探究硒纳米颗粒对类风湿关节炎大鼠的治疗效果及抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:30只SD健康雄性大鼠,由广西医科大学实验动物中心提供,3~6月龄,体质量200~250(220±7.9)g。大鼠均养殖于干净笼子中,室温(22.1±1.8)℃,相对湿度35%~40%,每天光照12 h,喂饮纯净水,饲养时间为1周。主要试剂:硒纳米颗粒(Hyclone公司);小鼠抗小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)抗体(Gibco公司);兔抗大鼠COX-2抗体(Invitrogen公司);苏木素(天根生化科技有限公司);TBST缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 建模及处理 取30只大鼠,10只不作任何干预,正常饲养,作为对照组;另外20只构建类风湿关节炎模型。使用10%的水合氯醛对大鼠进行麻醉,并将其按仰卧姿势置于操作台上,将头部及四肢进行固定。使用0.1 mol/L的醋酸将Ⅱ型胶原进行溶解并将其配制成2 mg/mL的Ⅱ型胶原溶液,并对大鼠的背部、尾根部及左后足跖皮内进行注射,每只大鼠注射0.25 mL,注射1 min后松开固定绳,将大鼠放回笼中使其自然苏醒。建模处理后大鼠出现多发性关节肿胀视为类风湿关节炎模型建立成功,最终建模失败1只,成功19只。将19只类风湿关节炎模型大鼠随机分为类风湿关节炎组10只和硒纳米颗粒组9只。对硒纳米颗粒组大鼠使用硒纳米颗粒溶液6 mg/kg进行灌胃处理,1次/d,连续处理3周;类风湿关节炎组大鼠使用生理盐水进行灌胃处理,用法用量与硒纳米颗粒组保持一致。三组大鼠在月龄、体质量上均无统计学差异(P均>0.05)。

1.3 足体积测量 对三组大鼠进行足体积测量,使用足趾容积测量仪,每5 d测量1次,共测量4次,对比三组大鼠不同时间点足体积变化情况。

1.4 关节炎指数计算 关节炎指数评分标准:无红肿为0分;小趾关节轻度红肿为1分;小趾关节和足跖肿胀为2分;踝关节下指甲肿胀为3分;所有指甲、关节肿胀为4分。按此标准对类风湿关节炎组和硒纳米颗粒组大鼠四肢病变程度进行评价,并累计积分,每5天评价1次,计算关节炎指数。

1.5 大鼠关节病理组织学观察 类风湿关节炎组和硒纳米颗粒组大鼠采用断头法处死,取大鼠的双侧踝关节关节软骨及软骨下骨标本,置于4%的多聚甲醛中固定,10%的EDTA中进行脱钙,矢状位取材,进行常规脱水石蜡包埋,切片备用。对大鼠切片样本进行HE染色处理,使用二甲苯进行常规脱蜡处理2次,每次5 min,然后在梯度乙醇下水化处理3 min,自来水冲洗1次;使用苏木素染色5 min,自来水冲洗1次;用浓度为1%的盐酸乙醇分化处理30 s,在0.2%氨水中反蓝处理2 min,自来水冲洗1次;用浓度0.5%伊红染色10 min,自来水冲洗1次;梯度乙醇脱水处理,最后用中性树胶封片,使用光学显微镜分析图像。

1.6 血清IL-6、TNF-α相对表达量检测 采用酶联免疫吸附试验法。分别取三组大鼠尾部静脉血5 mL,在抗凝管中保存,3 000 r/min,离心20 min,放入洁净的EP试管中,分离上层血清,-80 ℃中保存。50 mmol/L碳酸盐包被缓冲液将抗原进行溶解,浓度为10~20 μg/mL,96孔酶标板中加入100 μL/孔,4 ℃过夜保存。第2天舍弃包被液,采用PBST洗涤3次,每孔中加入1%的BSA 150 μL,37 ℃中封闭1 h。之后采用PBST洗涤3次,在每孔中加入100 μL不同倍比稀释度的血清,加入对照样品,37 ℃孵育2 h。采用PBST洗涤5次,加入100 μL,稀释后HRP标记的二抗,37 ℃孵育1 h。PBST洗涤5次,之后,使用显色剂显色20 min,在酶标仪上读取405 nm处吸光度值(A值)。

1.7 血清GSH-Px、COX-2相对表达量检测 采用Western blotting法。分别取三组大鼠尾部静脉血5 mL,在抗凝管中保存,3 000 r/min,离心20 min,放入洁净的EP试管中,分离上层血清,-80 ℃中保存,待用。用SDS-PAGE凝胶将待测标本进行电泳,加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液,静置15 min;在100 V的环境中电泳10 min后,将电转膜置于37 ℃封闭环境中的摇床上,然后加入10%的牛奶,静置1.5 h后加入TBST稀释,按(1∶1 000)稀释,在5 ℃下,孵育后过夜保存;第2天使用TBST缓冲液清洗,在室温环境中与二抗结合,孵育1 h后再次用TBST缓冲液清洗,最后将其浸泡在底物溶液中进行显色,采用BCA蛋白定量试剂盒,分析其灰度值,目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值=目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 大鼠关节病理组织学观察 如图1所示,类风湿关节炎组大鼠滑膜组织出现充血现象,细胞排列不规则,出现大量炎性细胞浸润的现象;硒纳米颗粒组大鼠关节滑膜组织受损情况及炎性细胞浸润相比类风湿关节炎组大鼠出现缓解。

图1 两组大鼠关节病理组织学观察(HE染色,×200)

2.2 三组大鼠不同时点足体积比较 见表1。

2.3 两组不同时点大鼠关节炎指数变化比较 见表2。

表1 三组大鼠不同时点足体积比较

注:与对照组相比,*P<0.05;与类风湿关节炎组相比,#P<0.05。

表2 两组不同时点大鼠关节炎指数变化比较

注:与类风湿关节炎组相比,#P<0.05。

2.4 三组大鼠不同时点IL-6、TNF-α相对表达量比较 见表3。

2.5 三组大鼠不同时点血清GSH-Px、COX-2相对表达量比较 见表4。

3 讨论

类风湿关节炎是一种慢性系统性自身免疫性疾病,是一种以炎性滑膜炎为主的慢性炎症[5]。类风湿关节炎症状会对患者的身体健康和生活质量造成一定威胁,若患者未及时接受治疗,类风湿关节炎症状未得到及时控制,病情发展严重,可能会出现患者关节畸形等恶劣后果[6]。

临床医学研究中对类风湿关节炎症状的发病机制及诱因尚未明确,有专家认为类风湿关节炎症状与遗传、感染及激素分泌有关,会造成微小血管的新生、细胞的增殖及骨组织损坏等[7,8]。目前能对类风湿关节炎症状进行安全有效治疗的药物较少,所以,如何对类风湿关节炎症状进行治疗是临床医学的一大难题[9,10]。

表3 三组大鼠不同时点IL-6、TNF-α相对表达量比较

注:与对照组相比,*P<0.05;与类风湿关节炎组相比,#P<0.05。

表4 三组大鼠不同时点血清GSH-Px、COX-2相对表达量比较

注:与对照组相比,*P<0.05;与类风湿关节炎组相比,#P<0.05。

硒元素是一种机体正常运转必不可少的微量元素,且硒元素被中国营养学会列入人体所必须的营养元素[11]。诸多专家学者通过大量临床实验研究证明,缺少硒元素会导致机体重要器官的正常运转出现异常,从而导致多种疾病的发生。有学者认为。类风湿关节炎症状发生,是由于患者免疫功能下降,从而导致关节出现炎症反应。硒元素是一种强效的免疫调节剂,能作为一种非特异刺激因素对机体体液免疫及细胞免疫系统进行有效刺激,从而一定程度上增强患者免疫能力[12]。本研究结果显示,在使用硒纳米颗粒进行干预后,类风湿关节炎模型大鼠的关节炎指数下降,说明使用硒纳米颗粒对类风湿关节炎大鼠进行干预,大鼠体内的硒元素得到补充,提高了大鼠的体液免疫及细胞免疫功能,从而缓解了类风湿关节炎模型大鼠的炎症反应严重程度,起到治疗效果。

GSH-Px是机体一种重要的过氧化物分解酶[13],硒半胱氨酸是GSH-Px的活性中心,所以GSH-Px活性的大小能直接反映出机体硒元素的含量。GSH-Px作为一种重要的过氧化物酶,能将机体内的过氧化氢及对机体有害的过氧化代谢产物清除,阻断机体脂质过氧化连锁反应,从而保护机体细胞结构及功能的完整性。COX-2由604个氨基酸组成,定位于细胞核膜,在多数组织中无表达,而在机体脑、肾、输精管及妊娠后胎盘中有定量表达,参与了排精、排卵及分娩等功能发生的过程,且生长因子、致炎因子等多种因素能诱导COX-2在细胞质和细胞核中表达,参与炎症反应,对损伤组织及机体免疫功能的修复起到促进作用[14,15]。本研究结果显示,使用硒纳米颗粒对类风湿关节炎模型大鼠进行干预,能对大鼠血清GSH-Px、COX-2的水平进行明显调控。IL-6、TNF-α是两种常用的炎症因子。IL-6能诱导其产生的来源范围较广,大量实验资料表明,IL-6在人体中参与多种炎症反应和疾病,是一种重要的促炎因子。TNF-α能影响身体的抗感染力,病毒感染或细菌感染越重,TNF-α水平就越高。在一般情况下可根据患者身体内的TNF-α水平来判断病情的严重程度。本研究结果显示,类风湿关节炎大鼠血清IL-6、TNF-α呈现异常高表达,在使用硒纳米颗粒进行干预后,类风湿关节炎大鼠血清IL-6、TNF-α水平得到明显调控,可能是因为使用硒纳米颗粒进行干预,对血清GSH-Px、COX-2水平进行调控,从而改善了模型大鼠的过氧化损伤及免疫能力,进而减轻了类风湿关节炎大鼠的炎症反应,起到了抗炎作用。

综上所述,硒纳米颗粒能有效改善类风湿关节炎模型大鼠的病情严重程度,并能通过调控血清GSH-Px、COX-2表达起到抗炎作用。

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