鲜姜汁对不同酵母菌抑制作用的研究

杨雷鹏

（山西师范大学，山西临汾 041000）

生姜，作为一种常见的香辛料，含有多种生物活性成分，如姜醇、姜酚、姜辣素等，具有抗氧化、抑菌、驱寒等功效，是药食两用作物[1]。医学研究方面，已经证明生姜对细菌有明显的抑制作用，还兼有软化血管、降血脂的功效，可用于治疗哮喘、肠道溃疡、心血管疾病等[2-3]。作为天然的抗氧化剂，生姜对于食品工业和人体健康有重要意义[4]。

目前，国内外对于生姜抑菌作用的研究主要集中在细菌方面，而对于生姜，特别是鲜姜汁对于酵母菌抑菌作用的研究则较少[5-6]。酵母是传统发酵工业的优良菌种，主要用于酒类酿造。酵母可利用不同的原料，在不同的发酵条件下产生各种产物，如脂肪酶、麦角固醇、谷胱甘肽、γ-氨基丁酸等，在食药等领域得到了广泛应用[7-9]。研究鲜姜汁对酵母菌的抑制作用，可为生姜高附加值产品（如生姜酒）的研发提供理论依据。国内外对于微生物抑菌作用的研究普遍采用的是牛津杯法测量抑菌圈直径，对微生物的抑菌作用进行观察[10]。与传统采用的滤纸片法相比，牛津杯法得到的数据更加准确和客观[11]，但这种方法在实际操作中会因为各种试验因素如抑制剂颗粒大小与渗透性等问题的存在而容易出现较大实验误差[12]。因此，仅靠单一的实验方法，确定鲜姜汁对酵母菌抑制作用的强弱存在一定的局限性。本研究以5 种常见酵母菌为材料，利用牛津杯法测定抑菌圈直径，并与DPPH、ABTS、FRAP 等常用抗氧化活性测定方法联用，来综合考察鲜姜汁对于酵母菌的抑菌作用，为鲜姜汁的进一步开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无硫生姜：鲜品，购置于临汾尧都区农贸市场。

供试菌种：试验所用5 种酵母菌W.anomalus J7-2、W.anomalus J11-2、W.anomalus J12-7、W.anomalus J15-2、W.anomalus J15-15，均为山西师范大学生命科学学院提供。

试验试剂：无水葡萄糖、麦芽粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限公司；DPPH、ABTS、TPTZ、水溶性维生素E（TE），北京伊诺凯科技有限公司；甲醇、冰乙酸、结晶乙酸钠、浓盐酸、过硫酸钾、氯化钠、水合氯化铁，天津科密欧化学试剂厂。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA22O4B 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD 型超净工作台，上海博讯实业有限公司；HPX-9272 MBE 型数显电热培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SHA-C 型水浴恒温振荡器，上海福玛实验设备有限公司；5804R 型高速冷冻离心机，德国基因有限公司；HH-6 型数显恒温水浴锅，江苏金坛荣华仪器制造有限公司，PH-3C 型pH 计，上海仪电分析仪器有限公司；752N 型紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鲜姜汁的制备

将鲜姜洗净晾干后，放入超净工作台中，用研钵研磨成汁，过滤后得到姜汁原液，再按照料液比鲜姜汁:水=1:1、1:2、1:4、1:8、1:16（g:mL）的比例对姜汁原液进行梯度稀释，得到5 个不同浓度梯度的鲜姜汁。

1.3.2 培养基制备

量取10 °Bx 的麦芽汁1 000 mL，加入15 g 琼脂，混合均匀后加热至琼脂完全溶解，调节pH 为6.0，趁热分装于250 mL 锥形瓶中，并制备试管斜面，灭菌。

1.3.3 菌种活化

将上述5 种酵母菌分别接入试管斜面，28 ℃恒温培养48 h，取出备用。

1.3.4 菌悬液制备

用接种环从试管斜面中挑取一定量活化后的酵母菌，放入装有10 mL 无菌水的试管中，放入恒温振荡器中振荡约10 min，使菌体散开。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 抑菌圈直径的测定

参考孟君等[13]的试验方法。取直径6 mm 的牛津杯，灭菌后备用。用移液枪吸取1 mL 菌悬液于麦芽汁琼脂培养基上，用涂布器涂布均匀；用无菌镊子夹取牛津杯紧贴在含酵母菌的培养基上，用移液枪吸取200 μL 鲜姜汁，每个平板上放置4 个同一种浓度梯度鲜姜汁的牛津杯，每个浓度重复3 次，取平均值作为最终结果；向牛津杯中移入200 μL 无菌水代替鲜姜汁作为空白对照进行实验。平板置于28 ℃恒温培养箱中培养48 h，取出后测定抑菌圈直径，比较不同浓度鲜姜汁对于不同种类酵母的抑菌效果。

1.4.2 抗氧化活性的测定

参考范祺、郭京波等[14,15]的试验方法。在麦芽汁液体培养基中接入1%上述5 种酵母菌菌悬液，并添加200 μL不同料液比的鲜姜汁为底物，28 ℃恒温培养3 d。培养完成后，将培养液全部移入离心管，用5 mL 蒸馏水洗涤三角瓶，洗涤液一同移入离心管，混合均匀后8 000 r/min离心15 min。离心完成后，吸取上清液，用蒸馏水定容到10 mL，分别进行DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、与Fe3+还原能力的测定，以三者相加后得到的总和，作为该酵母菌的总抗氧化活性。以未接种酵母菌的鲜姜汁作为空白对照进行试验。每次试验均设置三个平行，以平行实验误差不超过5%为标准，进行结果与数据分析。

2 结果与分析

2.1 牛津杯抑菌试验结果

本试验通过测定不同平板上5 种酵母菌W.anomalus J7-2、W.anomalus J11-2、W.anomalus J12-7、W.anomalus J15-2、W.anomalus J15-15 抑菌圈直径（单位：cm），确定不同浓度鲜姜汁对酵母菌的抑制作用，试验结果见图1。

如图1 所示，随着生姜料液比的逐渐减小，各个酵母抑菌圈的直径均开始逐渐变小。从图中可以看到，鲜姜汁对于不同酵母的抑制作用各不相同：W.anomalus J12-7 所对应的抑菌圈直径较其他4 种酵母而言最小，表明鲜姜汁对该菌种的抑制作用最弱；同理，W.anomalus J15-2 所对应的抑菌圈直径较其他4 种酵母而言最大，表明鲜姜汁对该菌种的抑制作用最强；因此选择受鲜姜汁抑制程度最小的酵母菌W.anomalus J12-7 进行后续试验。此外，就鲜姜汁料液比方面而言，当料液比为1:1时，对于各个酵母的抑制作用均相对较强；在料液比为1:1至1:8 之间时，曲线斜率较大，抑菌圈直径快速缩小；在料液比为1:8 至1:16 之间，曲线斜率较小，表明这一区间鲜姜汁对于酵母菌抑制作用较小，酵母菌得以持续生长繁殖，因此，考虑选用生姜料液比为1:8 进行后续试验。

2.2 抗氧化能力评价

试验以200 μL 料液比为1:8 的鲜姜汁为发酵底物，添加到麦芽汁液体培养基中，经上述5 种酵母菌进行发酵，测定鲜姜汁在发酵后的总抗氧化能力（单位：μmol TE/g Ginger juice，以下简称μmol/g），结果见图2。

如图2 所示，经5 种酵母发酵后，鲜姜汁的总抗氧化活性（TAC）之间差异显著，W.anomalus J7-2 为3 345.09±167.26 μmol/g；W.anomalus J11-2 为3 155.65±157.78 μmol/g；W.anomalus J12-7 为3 632.36±181.62 μmol/g；W.anomalus J15-2 为3 223.15±161.16 μmol/g；W.anomalus J15-15为3 023.84±151.19 μmol/g，而对照组总抗氧化活性仅为1 805.96±90.30 μmol/g。其中W.anomalus J12-7 的抗氧化活性最高，发酵力最强，发酵液气味较为柔和，姜辣味显著降低，并伴有淡淡的葡萄酒香味，表明其对于鲜姜汁转化程度最强。其余4 种酵母菌中，W.anomalus J11-2无明显特殊气味产生，姜辣味较为明显；W.anomalus J15-2 和W.anomalus J15-15 发酵产物有明显的啤酒气味，且姜辣味较浓；W.anomalus J7-2 产生较为浓烈的白酒味，对于生姜汁转化程度不如W.anomalus J12-7。

3 结论

本文通过研究鲜姜汁对5 种常见酵母菌的抑制作用，发现W.anomalus J12-7 无论是牛津杯抑菌试验，还是抗氧化能力评价，相对其他酵母菌而言，除具备较强耐受性能外，也展现出较高的抗氧化活性，这表明W.anomalus J12-7 在发酵过程中对于鲜姜汁中部分物质进行了分解与转化，并生成具有更高生物活性的物质，具体的转化物质与相对应的转化机理仍有待于进一步的试验研究。