施氮肥对6个树种间根尖功能性状关联的影响

李应　邓雨奇　林声威　王治博　唐水昌　康雨辰　庄子楠　许海武　王文娜

摘要：【目的】研究施氮肥對树种间根尖功能性状如解剖结构与形态特征和组织氮浓度的关联，及其对土壤氮素有效性的响应，为深入了解树木根系结构与功能的关联机制提供理论参考。【方法】以温带6个常见树种（包括针叶和阔叶）成熟人工林为试验材料，将连续两年施氮肥处理与不施肥处理进行比较，分析根尖的解剖结构和表型特征（形态特征和组织氮浓度）差异，并采用Pearson相关系数（r）和冗余分析（RDA）评价施肥处理对根尖解剖结构与形态特征和组织氮浓度在种间关系的影响。【结果】在不施肥处理中，根尖组织氮浓度与中柱直径和导管特征（平均导管直径、导管总数和总导管面积）在种间呈极显著负相关（r=-0.822～-0.523）（P<0.01，下同），与皮层厚度和皮层细胞层数呈极显著正相关（r=0.596～0.876）;根尖中柱直径和导管特征与根尖直径和组织密度在种间呈极显著正相关（r=0.434～0.798），与比根长呈极显著负相关（r=-0.852～ -0.655）;相比之下，根尖皮层特征与形态特征的相关性依赖于具体的指标。施氮肥增加了6个树种林分土壤氮的有效性，同时增加树种的根尖直径和组织氮浓度、降低比根长，而组织密度的变化依赖于树种。施氮肥后根尖的中柱和导管特征普遍显著增加（P<0.05），而皮层厚度和皮层细胞特征变化不显著（P>0.05）。施氮肥后，除了根尖组织氮浓度与皮层厚度和皮层细胞层数间的正相关程度在种间增强外（不施肥处理：r分别为0.596和0.876;施氮肥处理：r分别为0.746和0.935），根尖其他解剖特征与表型特征在种间的关联均普遍减弱。对根尖解剖指标进行RDA分析，发现中柱直径和平均导管直径对于形态特征和组织氮浓度改变的贡献最大，分别可解释其变化的59.4%（施氮肥处理）～68.9%（不施肥处理）和54.8%（施氮肥处理）～67.0%（不施肥处理）。【结论】在树种间，根尖解剖结构与形态特征和组织氮浓度紧密相关;施氮肥导致根尖组织氮浓度与皮层厚度和皮层细胞层数在种间的正相关性增强，根尖其他解剖结构与表型特征的相关性在种间普遍减弱。说明土壤氮有效性提高时，树木根尖功能性状表现出明显的树种差异，具有较厚皮层组织的树种根尖对养分具有更强的吸收优势。

关键词： 根尖;解剖结构;形态特征;氮浓度;施氮肥;种间关联

中图分类号： S725.5                               文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）12-2985-08

Abstract：【Objective】To study the association of nitrogen fertilizer application on root tip functional traits such as ana-tomical structure， morphological characteristics and tissue nitrogen concentration， and the effects on soil nitrogen availa-bility， which could provide theoretical basis for deeply understanding the mechanism of the connection between root structure and function in trees. 【Method】Taking two-year nitrogen fertilization as fertilization treatment and non-fertilized treatment as control. Comparing differences in anatomical structure and phenotypic characteristics of root tips， such as morphological traits and nitrogen concentration between unfertilized and fertilized treatments in six common temperate tree species including conifer and broad-leaved species from mature artificial forests. The effects of nitrogen fertilization on relationships between root tip anatomy versus morphology and between root tip anatomy versus nitrogen concentration among species were evaluated by Pearson correlation coefficient（r） and redundancy analysis（RDA）. 【Result】In the unfertilized treatment， nitrogen concentrations of root tips were extremely negatively correlated to both stele diameter and conduit traits among species（r=-0.822 to -0.523）（P<0.01， the same below）， and extremely positively correlated to cortical thickness and cortical cell traits（r=0.596-0.876）. Stele diameter and conduit traits both extremely positively correlated to root tip diameter and tissue density among species（r=0.434-0.798） and extremely negatively related to specific root length（r=-0.852 to -0.655）. By comparison， correlation between cortical cell traits and morphological traits depended on speci-fic indexes. Nitrogen fertilization increased soil nitrogen availability in six tree species. Nitrogen fertilization generally increased root tip diameter and nitrogen concentration， decreased specific root length in all species， while changes of tissue density differed among species. The stele radius and conduit traits of root tips also significantly increased after nitrogen fertilization（P<0.05）， while cortical thickness and cortical cell traits changed non-significantly（P>0.05）. After nitrogen fertilization， except for the increase of positive interspecific correlations between root tip nitrogen concentrations and both cortical thickness and the number of cortical cell layers（unfertilized： r=0.596 and r=0.876 respectively; fertilized： r=0.746 and r=0.935 respectively）， other interspecific correlations between anatomical traits and phenotypic characteristics were generally decreased. The results of RDA based on all anatomical traits of root tips in this study indicated that stele diameter and mean conduit diameter both contributed the most largely to the changes of root morphological traits and nitrogen concentrations， with the explanations for their variations up to 59.4% and 54.8% in the fertilized treatment and 68.9% and 67.0% in the unfertilized treatment， respectively. 【Conclusion】Generally， close correlations are found both between root tip anatomical traits versus root morphological traits and between root tip anatomical traits versus nitrogen concentrations among six tree species. Nitrogen fertilization strengthens the positive interspecific correlation between nitrogen concentrations in tissue and cortical thickness and the number of cortical cell layers， while generally weakens other interspecific correlation between anatomical structure and phenotypic characteristics. The results suggest that when  soil nitrogen availability improves，  root tip functional traits show large divergences among tree species， specifically tree species which possess thicker cortex of root tips should exhibit stronger absorptive advantage for nutrients.

Key words： root tip; anatomical structure; morphological trait; nitrogen concentration; nitrogen fertilization; interspecific correlation

Foundation item： Hainan Basic and Applied Basic Research Plan（Natural Science） High Level Talent Project（2019 RC159）;College Students Innovative Entrepreneurial Training Plan Project（201910589407）

0 引言

【研究意義】根尖作为植物地下最活跃的组分，其生理生态功能的变化已成为生态学研究的热点。根尖生理生态功能的改变，不仅对于植物个体的生长和存活具有重要影响，还在陆地生态系统碳和养分循环过程中发挥关键作用。根尖生理生态功能依赖于其解剖结构、形态特征和养分浓度等功能性状。其中，根尖的解剖结构由皮层和中柱构成，这两部分分别是资源吸收和运输的主要场所，其变化可影响根尖的形态及氮等养分特征，因此根尖的解剖结构是调控根尖生理和功能的潜在机制。以往的研究大多关注根尖功能性状的种内关联，而缺乏对树种间关联的探讨。因此，研究根尖解剖结构与形态和养分特征的种间关联，对于深入了解树木根系结构与功能的关联机制具有重要意义。【前人研究进展】近10年来，生态学家研究表明树木细根的解剖结构（皮层厚度、中柱直径和木栓层的形成等）与其他表层特征，如根形态特征和组织化学浓度等在种内存在紧密关联（陈海波等，2010;赵妍丽等，2011）。陈海波等（2010）在研究水曲柳苗木时发现，低氮条件下（1 mmol/L）细根直径增加是由皮层厚度和皮层细胞直径增加引起。还有一些研究关注了细根解剖结构与表型特征在种间的关联，发现中柱直径和皮层厚度2个指标与细根直径均显著正相关（Gu et al.，2014;Kong et al.，2014），且2个指标与组织氮浓度间的关系在皮层厚度中更紧密（Guo et al.，2008;王文娜，2018）。尽管当前研究已普遍证实细根解剖结构是调控根表型特征的重要因素，但对于细根表型特征与哪些解剖组分（皮层细胞直径、皮层细胞层数、导管总数和导管直径等）在种间存在重要关联尚缺乏关注。此外，土壤氮有效性变化是森林生态系统中十分常见的自然现象之一，在氮有效性改变条件下，细根解剖结构（Nagel et al.，2001;陈海波等，2010）、形态特征（Pregitzer et al.，2000;Noguchi et al.，2013;Kou et al.，2015）和组织氮浓度（Nadelhoffer，2000;Pregitzer et al.，2000;Jia et al.，2011）均发生相应改变，且变化方向和程度依赖于树种、施肥剂量和立地养分状况等。【本研究切入点】目前，关于土壤氮有效性改变条件下，树木根尖解剖特征（尤其是解剖组分特征）与形态特征和组织氮浓度在树种间的关联鲜有报道。【拟解决的关键问题】选取我国温带地区6个常见的造林树种，即胡桃楸（Juglans mandshurica）、黄波罗（Phellodendron amurense）、水曲柳（Fraxinus mandschurica）、落叶松（Larix gmeli-nii）、云杉（Picea koraiensis）和红松（Pinus koraiensis），在人工纯林中进行施氮肥处理，分析施氮肥对根尖解剖结构（皮层厚度、中柱直径、皮层细胞直径和导管总数等）、形态特征（根尖直径、比根长和组织密度）和组织氮浓度的影响，以及对解剖结构与形态特征和组织氮浓度在种间相关性的影响，为深入了解树木根系结构与功能的关联提供参考。

1 材料与方法

1. 1 研究区概况

在黑龙江省东北林业大学森林培育实验站（东经127°30′～127°34′，北纬45°21′～45°25′）内开展相关研究。该研究地点属于温带地区，受大陆性季风气候影响，年均温2.8 ℃，降水量和蒸发量分别为723和1094 mm。选取温带地区6种典型造林树种，包括胡桃楸、黄波罗和水曲柳3种阔叶树种，以及落叶松、云杉和红松3种针叶树种。研究树种均选自30年生人工纯林，平均海拔为300 m，坡度为10°～15°，株行距为1.5 m×2.0 m。林分土壤为典型暗棕壤，土层平均厚度为40 cm（Wang et al.，2006）。6个树种林分特征见表1。

1. 2 试验设计

1. 2. 1 施肥设计 在相似立地位置随机设样地，6个树种共设36块样地（样地规格4 m×4 m）。其中，每个树种林分内均设6块样地，使用红绳圈出边界。每个树种6块样地中，3块不施肥（不施肥处理），另外3块施肥（施氮肥处理）。样地选择在生长健康的目标树木周围，每个样方周围需围绕2～3棵树，保证后期取样具有足够根量。对块状样地进行连续2年的施氮肥（硝酸铵颗粒）处理，施肥时间分别为第1年和第2年生长季的5月末和7月末，以及第1年的8月初;每年施氮量为10 g/m2，每月施肥量根据往年当月的平均氮矿化量设置（Jia et al.，2011），于上述施肥月份分别施加当年总施肥量的30%、40%和30%。施肥前，首先清除杂草，再将凋落物层拨开，以各样地红绳为界在样地内均匀撒施肥料，之后将凋落物层重新覆盖地表。

1. 2. 2 取样 于施肥后第2年7月末对根系进行取样。在每块样地中随机选择3处取样点，将表层土壤（0～10 cm）的目标树种根系小心剪下，收获多个根段。根据根系的分支和弹性，挑选出目标树种根系。对于各树种而言，将同一块样地中获取的根系样品随机分成2组：一组小心清洗土壤杂质后迅速固定于FAA溶液中，用于之后根尖解剖结构的测定;另一组根系装入封口袋中，用于测定根尖的形态特征和组织氮浓度。在同一树种的各处理样地中，将来自3个样地中用于测定相同指标的样品合并，在同一塑料瓶或封口袋中放置。同时，使用5 cm内径土壤钻，在各树种同一样地中对根系取样区域附近的表层土壤进行收集。各样地共随机选取3处位置，将3份土壤样品混匀作为合并样品，用于测定土壤全氮、铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）浓度。于2 h内将以上样品带回实验室，置于低温或风干条件下保存，以待后续指标测定。

1. 3 根尖功能指标测定

1. 3. 1 根尖解剖结构测定 在实验室环境下将根系从FAA溶液中取出，通过根尖的外形特征，将根尖从复杂的根系统中摘下，用于解剖结构测定。从同一树种相同处理中随机挑选出30个根尖，使用石蜡切片法对样品进行前期处理（Guo et al.，2008）。制片后，使用光学显微镜（BX-51，Olympus Corporation，Japan）对根尖横截面进行观察和图片拍摄（Gu et al.，2011）。根尖的中柱直径、平均导管直径、皮层厚度和皮层细胞直径等使用Motic Images Plus 2.0（Motic Corporation，China）进行测量。

1. 3. 2 根尖形态特征测定 从同一树种的相同处理中随机选择100～200个根尖，使用Expression 10000XL 1.0 scanner（Epson Telford Ltd，UK）扫描根尖，然后以WinRhizo 2004b（Regent Instruments，Inc.，Québec，Canada）测量根尖的平均直径、总体积和总长度。将已扫描的根尖烘干后称量干重（精确度0.0001 g）。对每组根尖样品的总长度与干重比值进行计算，获得根尖比根长（cm/mg）;计算根干重与总体积比值，获得根尖组织密度（mg/cm3）。

1. 3. 3 根尖组织氮浓度测定 随机挑选一些根尖，于65 ℃下烘干并研磨后，使用元素分析仪（vario MACRO，Elementar Analysensysteme，Germany）测定根尖组织氮浓度。

1. 3. 4 土壤全氮和速效氮浓度测定 将同一树种相同处理的土壤样品，使用四分法分为2份。其中，一份低温（4 ℃）保存，经2 mol/L KCl溶液浸提30 min后，采用连续流动分析仪（AA3，AutoAnalyzer，Germany）测定浸提液中的NH4+-N和NO3--N浓度（mg/kg）;另一份土壤样品置于阴凉通风的环境中风干，将研磨后的粉末过100目筛后，使用元素分析仪测定土壤全氮浓度（mg/kg）。

1. 4 统计分析

对于同一树种不同处理的根尖样品，分别计算其解剖结构（中柱直径、导管平均直径、导管总数、皮层厚度、皮层细胞层数和皮层细胞直径）、形态特征（根尖直径、组织密度和比根长）和组织氮浓度的均值及标准误差。采用Fishers LSD检验施氮肥处理对根尖解剖结构、形态特征和组织氮浓度的影响;采用Pearson相关系数（r）和冗余分析（RDA）评价根尖解剖结构与形态特征和组织氮浓度在树种间的相关关系。采用SPSS 19.0分析数据;使用SigmaPlot 10.0（Systat公司，美国）制图。

2 结果与分析

2. 1 不施肥处理根尖解剖结构与形态特征间的关联

在不施肥处理下，根尖解剖结构与形态特征在种间存在普遍且紧密的相关性（表2，图1）。其中，根尖直径、组织密度与中柱直径和导管特征（平均导管直径、导管总数和总导管面积）间均呈极显著正相关（r =0.434～0.798）（P<0.01，下同），而比根长与中柱和导管特征间呈极显著负相关（r =-0.852～-0.655）。与中柱和导管特征不同，根尖皮层特征与形态特征在树种间的关系依赖于具体指标（表2）。

此外，不施肥处理下根尖组织氮浓度与解剖特征在6个树种间也存在紧密关联（表2）。其中，根尖组织氮浓度与中柱和导管特征间均呈极显著负相关，与中柱直径的相关性最紧密（r =-0.822），其次为平均导管直径（r =-0.787）、总导管面积（r=-0.631）和导管总数（r =-0.523）。根尖组织氮浓度与皮层细胞直径间亦呈极显著负相关（r =-0.445），但与皮层厚度和皮层细胞层数间呈极显著正相关（r分别为0.596和0.876）。整体而言，通过RDA分析检验不施肥处理中根尖解剖结构对形态特征和组织氮浓度在种间的影响，结果表明，第一轴和第二轴分别能解释形态特征和组织氮浓度变化的77.0%和10.8%（图1）。其中，解剖特征中的中柱直径和平均导管直径对于形态特征和组织氮浓度变化的贡献最大，分别可解释其变化的68.9%和67.0%。

2. 2 施氮肥对根尖解剖结构、形态特征和组织氮浓度的影响

由表3可知，施氮肥后6个树种林分土壤全氮、NH4+-N和NO3--N的浓度均明显增加，其中NH4+-N和NO3--N浓度的增加在6个树种中普遍达显著水平（P<0.05，下同）。由表4可知施氮肥導致6个树种（除水曲柳外）根尖的中柱直径普遍显著增加，其中，红松的增幅最大（28.26%），落叶松的增幅最小（13.37%）。施氮肥同样导致6个树种根尖平均导管直径和总导管面积显著增加，2个指标在树种间的增加范围分别为9.98%（胡桃楸）～31.81%（水曲柳）和76.70%（云杉）～162.60%（水曲柳）。施氮肥后仅在胡桃楸、黄波罗、落叶松和红松的根尖导管总数显著增加，分别增加74.03%、41.87%、66.34%和50.20%，而在水曲柳和云杉中导管总数增加不显著（P>0.05，下同），分别增加41.87%和6.42%。与中柱和导管特征相比，根尖的皮层厚度、皮层细胞直径和皮层细胞层数变化不显著，3个指标在树种间的变化程度分别为-7.99%～0.10%、-10.39%～0.99%和-3.93%～0.45%。

由表5可知，施氮肥后根尖直径在所有树种（除云杉外）中普遍显著增加，树种间增加范围为6.25%（黄波罗）～29.63%（胡桃楸）。根尖比根长在施氮肥后普遍降低，其中在胡桃楸和水曲柳中达显著水平，分别降低26.92%和20.15%。然而，根尖组织密度的变化依赖于树种，但变化普遍未达显著水平，树种间的变化程度为-10.69%（胡桃楸）～3.16%（黄波罗）;仅在红松中显著降低（降低13.13%）。此外，施氮肥导致根尖组织氮浓度在胡桃楸、水曲柳、黄波罗、红松和云杉中均显著增加，分别增加21.16%、6.72%、23.47%、6.63%和4.47%，而在落叶松中增加不显著。

2. 3 施氮肥对根尖功能性状在种间关联影响的分析

施氮肥后根尖解剖结构与形态特征和组织氮浓度在6个树种间仍存在普遍显著相关（图2，表2）。与不施肥处理相比，施氮肥导致根尖解剖结构与形态特征间的相关性在6个树种中普遍减弱。其中，根尖直径与中柱和导管特征间的相关系数由不施肥处理的0.639（根尖直径与平均导管直径间）～0.798（根尖直径与导管总数间）降低至施氮肥处理的0.495（根尖直径与导管总数间）～0.648（根尖直径与中柱直径间）。类似地，不施肥处理中根尖组织密度与中柱和导管特征间的相关性（r由0.434～0.713降至0.434～0.635），以及比根长与中柱和导管特征间的相关性（r由-0.852～-0.655升至-0.763～-0.508）均在施氮肥处理后稍降低。在不施肥处理中，根尖形态特征与皮层特征在种间呈显著相关，相关程度在施氮肥后也呈现一致性下降的规律。相比之下，施氮肥后根尖解剖结构与组织氮浓度在种间的相关性变化依赖于具体指标（表2）。其中，与不施肥处理相比，施氮肥处理中组织氮浓度与中柱直径（r由 -0.822升至 -0.664）、导管总数（r由-0.523升至 -0.304）、平均导管直径（r由-0.787升至-0.721）和总导管面积（r由-0.631升至-0.538）间的负相关程度均减弱，但仍然普遍达到显著水平;而根尖组织氮浓度与皮层特征间的相关性变化并不一致，其与皮层厚度和皮层细胞层数间的相关程度在施肥后增加（r由0.596和0.876分别增至0.746和0.935），与皮层细胞直径间的相关程度在施氮肥后降低（r由-0.445升至-0.184）。通过RDA分析施氮肥处理中根尖解剖结构对形态特征和组织氮浓度在种间的影响发现，第一轴和第二轴分别能解释形态特征和组织氮浓度变化的76.3%和11.3%（图2）;与不施肥处理（图1）相似，中柱直径和平均导管直径对于形态特征和组织氮浓度改变的贡献最大，分别可解释其变化的59.4%和54.8%。

3 讨论

本研究表明，不施肥处理中6个树种根尖解剖特征与形态特征和组织氮浓度在种间均存在普遍关联。其中，根尖中柱直径和导管特征与根尖直径和组织密度在所有树种间显著正相关，与比根长在种间显著负相关。Gu等（2014）、Kong等（2014）分别对50和96个树种根尖的研究也得出相似的结果。因此，类似于形态特征与解剖特征在种内的紧密关联（Guo et al.，2008;陈海波等，2010），根尖形态特征在种间也是表征中柱和导管特征变化的重要指标。而对于根尖皮层特征，其与形态特征在种间的关联是否达显著水平依赖于具体的指标，因此相比之下，根尖中柱和导管特征与形态特征在种间具有更普遍的关联。此外，本研究还发现，根尖组织氮浓度与解剖特征在树种间也存在普遍的紧密关联，即在不同树种间，根尖组织氮浓度与皮层厚度显著正相关，而与中柱直径和导管特征紧密负相关。组织氮浓度与皮层厚度在种间的正相关在对96个树种根尖的研究中也得到证实（Kong et al.，2014）。综合以往研究（Guo et al.，2008）和本研究发现，具有较粗中柱直径的树种根尖，其皮层厚度相对较薄，反之亦然。因此，以上结果可能说明在皮层较厚、中柱较细且导管较细、少的树种根尖中，组织氮浓度相应更高。

施氮肥后6个树种林分土壤氮有效性提高，不仅改变各树种根尖解剖结构、形态特征和组织氮浓度，还导致根尖功能性状在种间的关系发生改变。首先，施氮肥后根尖组织氮浓度与解剖组分中的皮层厚度和皮层细胞层数在种间的正相关程度增强。在土壤氮有效性增加的条件下，根尖组织氮浓度在以往研究（Pregitzer et al.，2000;Jia et al.，2011）和本研究中均明显增加，且在根尖皮层较厚的树种中普遍增加更明显。这是因为皮层是根尖吸收水分和养分的主要场所，较厚的皮层组织能为根尖氮元素的吸收提供更多优势（Nagel et al.，2001;Guo et al.，2008）。其次，不论在针叶树还是阔叶树中，施氮肥后根尖组织氮浓度的增幅在种间均随着中柱和导管特征的增强而普遍增加。由于较发达的中柱和导管特征意味着更强的根尖运输功能（Wahl et al.，2001;Wang et al.，2018），故推测具有较粗中柱、较高导管直径和数量的树种，其根尖在氮有效性增加条件下对氮元素的吸收具有更强的优势。尽管施氮肥后中柱和导管较发达的树种中根尖组织氮浓度的增加量较大，但這种变化并未改变氮浓度与中柱和导管特征在种间负相关的关系。此外，施氮肥还导致根尖解剖特征与形态特征在种间的关联性普遍下降，其直接原因是根尖解剖结构和形态特征对施氮肥的响应结果在树种间具有差异。施氮肥后3个阔叶树种（胡桃楸、黄波罗和水曲柳）的根尖直径和中柱直径均增加，但这2个指标在种间增加规律不一致，胡桃楸、水曲柳和黄波罗根尖直径的增幅分别为29.63%、18.52%和6.25%，而中柱直径分别增加20.11%、17.55%和20.24%。这种根尖功能性状在种间的响应差异，说明根尖结构和功能对土壤氮有效性的响应策略具有树种差异。总之，本研究证实了根尖功能性状在种间具有紧密关联，以及功能性状在施氮肥后会发生协同改变。此外，大量研究发现，在根尖对水分和养分吸收过程中，菌根真菌侵染是一个重要的吸收途径（Wright et al.，1998;Smith and Smith，2012;Bücking and Kafle，2015）。但根尖菌根侵染率的改变与根尖解剖结构、形态特征和组织氮浓度的变化具有何种关联机制仍不清楚，今后可选取不同菌根侵染类型的树种进行重点研究。

4 结论

在树种间，根尖解剖结构与形态特征和组织氮浓度紧密相关;施氮肥导致根尖组织氮浓度与皮层厚度和皮层细胞层数在种间的正相关性增强，根尖其他解剖结构与表型特征间的相关性在种间普遍减弱。说明土壤氮有效性提高时，树木根尖功能性状表现出明显的树种差异，具有较厚皮层组织的树种根尖对养分具有更强的吸收优势。

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（責任编辑 邓慧灵）