猕猴桃根结线虫形态观察与病原鉴定

舒然　李磊　龙友华　顾桂飞　张竹竹　尹显慧

摘要：【目的】明确贵州猕猴桃根结线虫的种类，为猕猴桃根结线虫病的防治提供理论依据。【方法】从贵州省修文、息烽和大方县采集感染根结线虫的猕猴桃植株，利用改良的贝曼漏斗法分离根结线虫，采用显微镜和扫描电镜对猕猴桃根结线虫进行形态观察与测量，结合分子生物学方法对线虫进行鉴定。【结果】猕猴桃根系被根结线虫侵染后产生根结或瘤状物，形成大小不等的根瘤，直径为0.5～1.0 cm;直径1.5～2.0 mm的须根受害较重，被侵染的须根产生单个或串生结节状肿瘤，瘤状物呈椭圆或近球形。猕猴桃根结线虫雌虫的排泄孔至头端的距离是口针的1倍左右，口针微微向背部弯曲，唇盘呈哑铃状，侧唇与中唇和唇盘分开，分界明显;雄虫唇盘大而圆，比中唇高，中唇外围圆滑，与唇盘分界明显。猕猴桃根结线虫种群与GenBank的南方根结线虫MK784570、KP234265和KF041336等线虫的序列相似度达99%。【结论】侵染贵州省修文、息烽和大方县猕猴桃的根结线虫为南方根结线虫（Meloidogyne incognita）。

关键词： 猕猴桃;南方根结线虫;形态观察;鉴定;贵州省

中图分类号： S432.45;S436.634.1                  文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）12-2971-07

Abstract：【Objective】To clarify the species of kiwifruit root-knot nematodes and provide  reference for the prevention and treatment of kiwifruit root-knot nematodes. 【Method】In this experiment， kiwifruit plants infected with root-knot nematodes were collected from Xiuwen， Xifeng and Dafang in Guizhou， the modified Bayman funnel method was used to isolate root-knot nematodes， and root-knot nematodes were observed and detected using morphological features and molecular biology methods， and identified by molecular biology. 【Result】Root nodules or nodules were formed in the roots of the injured kiwifruit， and nodules of different sizes were formed， with diameters ranging from 0.5 to 1.0 cm. The fibrous roots with diameter at 1.5-2.0 mm were severely damaged， and the infected fibrous roots produced single or serial nodular tumors， and the tumors were elliptical or subspherical. The distance from the excretory hole to the head of the female root-knot nematode of kiwifruit was about oncec as that of the mouth needle， the needle was bent slightly toward the back， the lip disc was dumbbell-shaped， the lateral lip was separated from the middle lip and the lip disc， and the boundary was obvious. The males lip disc was large and round， higher than the middle lip， and the middle lip clearly demarcated from the lip disc. The nematode population had 99% sequence similarity with the nematodes MK784570， KP234265 and KF041336 from GenBank.【Conclusion】The results show that the root-knot nematode infected Xiuwen， Xifeng and Dafang kiwifruit in Guizhou is Meloidogyne incognita.

Key words： kiwifruit; Meloidogyne incognita; morphological observation; identification; Guizhou

Foundation item： Guizhou Science and Technology Support Plan Project（QKHZC〔2018〕2058，QKHZC〔2019〕2406）

0 引言

【研究意義】猕猴桃也称奇异果，其口感酸甜，富含维生素C，在我国广泛种植（张安世等，2018）。目前，贵州省猕猴桃栽培面积排名全国第三，仅修文县猕猴桃种植面积就超过1.0万ha。随着猕猴桃栽培区域的扩大，猕猴桃病害发生日益严重，其中根部病害以根结线虫侵害为主（敖礼林和饶卫华，2000），常造成猕猴桃植株的根部肿大呈瘤状或根结状，引起地下病根腐烂（刘计权，2014），营养物质运输通道受阻（郭衍银等，2004），严重降低猕猴桃果实产量及品质。根结线虫病已成为制约贵州猕猴桃产业发展的主要问题之一。因此，对猕猴桃根结线虫进行准确鉴定，并采取针对性防治措施，对保障贵州猕猴桃产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】根结线虫属杂食性专性寄生虫（龙海等，2016;王虹云等，2018），1855年首次在英国报道（张燕霞，2011）。目前，在我国不同猕猴桃产区均有根结线虫发生危害的报道。方炎祖等（1991）报道，侵染湖南猕猴桃的根结线虫种类主要是花生根结线虫（Meloidogyne arenaria）和南方根结线虫（M. incognita），以南方根结线虫为优势种群;张绍升等（1993）研究表明，福建建宁猕猴桃根结线虫为爪哇根结线虫（M. jaranica）和南方根结线虫，以爪哇根结线虫为优势种群;范学科和党占平（2007）使用雌成虫会阴花纹及形态测量对猕猴桃根结线虫进行鉴定，发现危害陕西关中地区猕猴桃的线虫为南方根结线虫。以上研究均采用传统的形态学特征对猕猴桃根结线虫进行鉴定。鉴于使用形态观察与测量鉴定线虫存在一定误差，陈文等（2018）结合会阴花纹鉴定和分子生物学手段对贵州省修文县的20份样本进行鉴定，结果表明侵染修文县猕猴桃的线虫种类为南方根结线虫;刘晨等（2018）采用形态学及PCR鉴定方法对陕西省周至县猕猴桃根结线虫进行鉴定，明确其危害种类为南方根结线虫。近年来，分子生物学技术快速发展，分子生物学鉴定方法已成为线虫种类鉴定的重要手段之一（何清聪等，2020），ITS序列分析已应用于黄瓜（黄英凯，2014）、烟草（杨艳梅等，2017）、花椒（曹业凡等，2019）、水稻（吕军等，2019）和柑橘（何清聪等，2020）等不同作物上根结线虫的种类鉴定。【本研究切入点】目前，有关贵州猕猴桃受根结线虫侵染后的根部形态、线虫形态描述及线虫危害特征等尚未见详细报道。【拟解决的关键问题】采用显微镜和扫描电镜对贵州猕猴桃根结线虫进行形态观察与测量，以分子生物学手段为辅助鉴定猕猴桃根结线虫种类，并对其危害特征进行描述，以期为贵州猕猴桃根结线虫病的防治提供理论支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

猕猴桃受害病根采集于贵州省修文、息烽和大方县猕猴桃基地。将根结症状典型的猕猴桃根部冲洗干净，晾干表面水分。采用改良的贝曼漏斗法分离根结线虫：先将发病的根部组织切成约1 cm的碎段，用双层纱布包好后放入有清水的漏斗中，线虫在趋水性和引力的作用下从猕猴桃根部组织中逃逸出来，并在水中游动，会沉降至漏斗底部末端的橡皮管中;24 h后打开止水夹将止水橡皮管中的水和线虫引入干净烧杯，从中吸取5 mL的水样在3000 r/min离心3 min，倒掉上清液再将底部沉降剩余的线虫倒入20 mL盛有无菌水的培养皿中，得到分离的线虫，4 ℃保存备用。

1. 2 猕猴桃发病根部组织观察

采用次氯酸钠—酸性品红染色法（张燕等，2011），褪色完毕后切片置于电子显微镜（徕卡DM750，上海孚约商贸有限公司）下观察、拍照。

1. 3 根结线虫形态扫描电镜观察

用塑料吸管将分离获得的线虫转移至培养皿中用蒸馏水清洗数次，缓慢加热杀死线虫后移入4 ℃冰箱存放2 h取出进行固定;再转移至4 ℃条件下固定24 h，用去离子水清洗5～6次以彻底清除戊二醛，完成后转移至5%锇酸中，25 ℃下静置2 h，用去离子水清洗下线虫上的锇酸，将固定好的线虫依次置于不同浓度梯度的乙醇中脱水20 min。使用环氧树脂干燥法处理线虫，镀膜完成后将线虫置于扫描电镜（MERLIN扫描电子显微镜，德国ZEISS公司）载物台上喷金观察（郭素枝等，2005;段玉玺，2011）。

1. 4 根结线虫形态鉴定

形态特征鉴定：参照张淑玲等（2019）的方法，先将线虫加热杀死并固定，线虫脱水后制成玻片，然后使用显微镜观察、测量并记录数据。线虫雌虫形态计数测量：观察线虫头部特征，主要记录指标为体长（L）、最大体宽（W）、口针长度（Stylet）、口针基部球高和宽（Stylet knob height、Stylet knob width）、背食道腺开口至口针基部距离（DGO）和排泄孔至头端距离（Ex.P.）等值，显微计数测量采用de Man公式。线虫雄虫形态计数测量：观察线虫头部和尾部主要特征，主要记录指标包括最大体长（L）、最大体宽（W）、体长/体宽（a）、口针长度（Stylet）、口针基部球高和宽（Stylet knob height、Stylet knob width）、背食道腺開口至口针基部距离（DGO）和交合刺长度（Spicule）等值。

1. 5 根结线虫分子生物学鉴定

在光学显微镜下根据形态初步确定为同种线虫后，将20～30条2龄线虫参照张喆（2016）的方法提取根结线虫DNA。利用线虫rDNA-ITS的通用引物TW81（5'-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3'）和AB28（5'-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系50.0 μL：DNA模板20～50 ng，Taq聚合酶0.5 μL，dNTP 2.0 μL，10× Tap Buffer （Mg2+） 5.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，加ddH20至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环;72 ℃延伸8 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。以MEGA 6.0中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2. 1 根结线虫侵染后猕猴桃根部症状

猕猴桃根系被根结线虫侵染后产生根结或瘤状物（图1），形成大小不等的根瘤，直径为0.5～1.0 cm，长出瘤状物的须根部位开始变黑至腐烂。根系洗净后根瘤状部位变黄，呈现明显的畸形生长状态。直径在1.5～2.0 mm的猕猴桃须根受害较重，被侵染的须根产生单个或串生结节状肿瘤，瘤状物呈椭圆或近球形。根肿瘤有时会长出小根茎，小根茎被侵染后会产生次生根结根瘤（图1-B）。受侵染的根产生的根结组织早期呈淡黄色（图1-D），后期变坏死亡呈黑色，且较小的细根容易断裂后腐烂。

2. 2 根结线虫侵染后猕猴桃根部解剖形态

猕猴桃健康正常根系（图2-A和图2-B）与被侵染根系（图2-C、图2-D、图2-E和图2-F）组织相比结构发生较大变化，未被侵染的根系发育正常，根的皮层与维管束组织细胞排列整齐，被侵染的根系可观察到根结线虫在寄主皮层细胞移动（图2-E），根结线虫转移至维管组织中后继续危害取食。未被侵染的根系维管组织细胞排列整齐一致，各组织间的界限清晰可见，被侵染根系各组织间的界限模糊不清，且根系维管组织中形成了巨型细胞（图2-D）。被侵染后发病形成的巨型细胞的细胞质浓厚、多核，发育的细胞随意排列，严重变性;同时，形成的巨型细胞阻隔了植物根系中央的维管组织（图2-F）。巨型细胞发育成熟后植株根系即出现明显的结节。部分巨型细胞在后期会出现空洞和衰败凋亡。

2. 3 根结线虫的形态描述

从修文县、息烽县和大方县3个猕猴桃种植区共分离到1006个根结线虫样品，根据形态初步确定为同种线虫。猕猴桃根结线虫雌性线虫虫体呈球形、梨形（图3-A），口针长13～15 μm，锥部微微向背部弯曲，基部呈球形或扁圆形。排泄口在口针基部附近（图3-B和图3-D），扫描电镜下唇区的唇盘稍微隆起，中唇近半圆形（图3-C）。中唇与唇盘融合形成哑铃状，唇区融合或分界明显（图3-C）。雌虫的侧区表现不明显，有一些弯向阴门的线纹。雌虫的口针较粗，微微向背部弯曲，通常长度20.4～25.6 μm，基部球形，背食道腺开口于口针基部后3 μm处，排泄孔位于食道腺中部（图3-B和图3-D）。

雄性线虫呈蠕虫形，虫体粗大、体型较长，虫体上体环明显（图4-A和图4-B）。扫描电镜下的唇区中部凹陷，唇盘大而圆，比中唇高;中唇外部圆滑，比唇盘窄，与唇盘之间分界明显，侧器口裂缝状，位于唇盘两侧下方（图4-C）;唇环不明显且不完整;精子呈圆形，交合刺長约30 μm，无交合伞微微腹弯，末端钝圆（图4-D）。

2. 4 根结线虫形态测量结果

由表1可知，雌虫体长356.6～789.8 μm，体宽318.7～567.6 μm，口针长度12.6～15.7 μm，口针基部球高和宽分别为1.6～2.7和2.7～4.6 μm。背食道腺开口至口针基部距离为2.6～5.3 μm，排泄孔至头端距离/口针长度的比值为0.7～1.8。雄虫体长达1567.0～2109.0 μm，a和b值分别为39.34～67.89和8.7～16.8，口针长度17.8～26.8 μm，口针基部球高度和宽度分别为2.4～4.7和4.2～6.9 μm，交合刺长20.9～37.9 μm。以上各形态的测量计算值与南方根结线虫基本一致。

2. 5 根结线虫分子鉴定结果

选用线虫通用引物进行PCR扩增，结果见图6。目的条带清晰、明亮，表明rDNA-ITS纯度较高，结构完整，大小约1000 bp。

2. 6 根结线虫rDNA-ITS序列系统进化树构建

将上述经纯化和测序得到的序列（大小为955 bp）提交至NCBI进行BLAST搜寻，获得与本测序序列相似度较高的17个序列。基于根结线虫的rDNA-ITS序列使用MEGA 6.0构建系统发育进化树。由图7看出，本研究的猕猴桃根结线虫种群以99%的支持率与GenBank的17个南方根结线虫种群聚在一个支系上，与南方根结线虫MK784570、KP234265和KF041336等线虫的序列相似度达99%。由此可确定本研究采集的侵染猕猴桃的根结线虫为南方根结线虫（M. incognita）。

3 讨论

猕猴桃当前已作为贵州省精品水果进行大力发展，是农民增收致富的重要经济作物之一，而种植过程中的病害危害已严重威胁其产业发展（常青，2019）。其中线虫侵害是猕猴桃生产上的主要病害之一，猕猴桃根结线虫主要危害植株根部，从苗期到成株均可受害。

本研究观察被线虫侵染的猕猴桃根部，发现受害的猕猴桃根部产生根结或瘤状物，形成大小不等的根瘤，直径在0.5～1.0 cm，与梁朋（2012）的研究结果一致。本研究病原线虫主要特征为：雌虫的排泄孔至头端的距离是口针的1倍左右，口针微微向背部弯曲，唇盘呈哑铃状，侧唇与中唇和唇盘分开，分界明显;雄虫唇盘大而圆，比中唇高，中唇外围圆滑，与唇盘分界明显，与Eisenback（1985）、黄英凯（2014）的描述基本相符。

本研究从田间采集猕猴桃根部发病部位经室内分离获得线虫，并对猕猴桃根结线虫进行形态观察与形态测量，基于rDNA-ITS序列构建系统发育进化树，结合特异性扩增条带，明确了贵州省修文、息烽和大方县猕猴桃园发生的根结线虫为南方根结线虫，与范学科和党占平（2007）、陈文等（2018）的研究结果一致。猕猴桃根结线虫种类多样，研究发现，我国猕猴桃上的根结线虫病主要由花生根结线虫（方炎祖等，1991）、爪哇根结线虫（张绍升等，1993）和南方根结线虫（范学科和党占平，2007）引起。近年来，贵州从外省大量引进猕猴桃苗木，本研究仅发现了南方根结线虫，究其原因可能是试验样本采集区域仅限于一个基地且样本数量少。本研究仅从形态学特征和分子生物学手段初步鉴定侵染猕猴桃的根结线虫种类，至于贵州猕猴桃根结线虫发生规律、群体分布和侵染机制等方面有待进一步探究。

4 结论

结合形态学和分子生物学方法，明确侵染贵州省修文、息烽和大方县猕猴桃的根结线虫种类为南方根结线虫，并对其形态特征和危害症状进行描述，为猕猴桃根结线虫防治提供了一定理论基础。

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（责任编辑 麻小燕）