云南省腾冲市牛羊感染梨形虫的分子流行病学调查

沈雪鹰，何志海，傅国璋，姚明国，张云，江佳富，孙毅，蒋宝贵，刘洪波，杜春红*

(1. 云南省地方病防治所，云南 大理 671000；2. 云南省腾冲市动物疫病控制中心，云南 腾冲 679100；3. 大理大学公共卫生学院，云南 大理 671000；4. 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071；5. 中国人民解放军疾病预防控制中心,北京 100071)

梨形虫(Prioplasma)属顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa)、梨形虫目(Piroplasmida)的原虫，对动物致病的重要梨形虫大多数属于巴贝斯虫属(Babesia)和泰勒虫属(Thelieria)，可引起巴贝斯虫病和泰勒虫病，既往也称为“焦虫病”、“血孢子虫病”等。临床症状以高热、贫血、黄疸、消瘦和血红蛋白尿为主，慢性和隐形感染者可导致动物产肉量和产毛量下降，是一种分布广泛、严重影响养殖业发展、经蜱传播的重要血液原虫病，有部分巴贝斯虫，如分歧巴贝斯虫、微小巴贝斯虫、猎户巴贝斯虫对人也有致病性。该疾病的地理分布和发病季节均与蜱类的分布和活动密切相关。腾冲市位于云南省西部边陲，北部和西北部与缅甸联邦共和国接壤，是中国通向南亚、东南亚的重要门户和节点。境内森林资源丰富，森林覆盖率达70.7%，横贯全境的高黎贡山，因具有较高的生物多样性特征，被联合国教科文组织列为“生物多样性保护圈”。适宜的气候和植被环境，给媒介昆虫的繁衍造就了天然条件。而畜牧业是腾冲市发展农村经济的重要产业，随着养殖产业的发展，家畜运输和交易频繁，将导致动物传染病随之扩散。为进一步全面了解本市家畜梨形虫病的流行状况和特点，本研究首次对我市养殖的牛羊进行梨形虫病分子流行病学调查，旨在为梨形虫的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 家畜血样采集

在云南省腾冲市曲石、滇滩、中和、猴桥、界头、芒棒、腾越、明光、荷花、固东、蒲川等11个乡镇采集牛、羊血样758份，其中牛331份，羊427份。采样区分布见图1。用一次性静脉采血针和无菌EDTA抗凝管采集动物颈静脉血，放冷藏箱中保存，带回实验室进行相关检测。

1.2 试剂

血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit, lot:03625)，DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)(Thermo Fisher Scientific)，DL2000 DNA Marker(Takara)。

图1 调查样本采集区分布

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取

取200 μL抗凝血液到2 mL PE管中，按照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。

1.3.2 梨形虫18S rRNA基因PCR扩增

采用泰勒虫属和巴贝斯虫属在内的梨形虫科原虫通用引物(上海生工生物工程股份有限公司合成)、Touch-Down PCR扩增梨形虫18S rRNA基因。第1轮扩增引物为Piro0F_(5′-GCCAGTAGTCATATGCTTGTGTTA-3′)和Piro6R_(5′-CTCCTTCCTYTAAGTGATAAGGTTCAC-3′)；第2轮扩增引物为Piro1F_(5′-CCATGCATGTCTWAGTAYAARCTTTTA-3′)和Piro5.5R_(5′-CCTYTAAGTGATAAGGTTCACAAAACTT-3′)。预期片段大小约为1 600 bp。

反应条件：第1轮和第2轮扩增条件相同，95 ℃预变性3 min，前20个循环：95 ℃变性30 s，60→50 ℃退火30 s(每个循环退火温度下降0.5 ℃)和72 ℃延伸1 min 30 s；后10个循环：95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s和72 ℃延伸1 min 30 s，最后72 ℃终延伸7 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 序列测定与分析

PCR阳性扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。利用CLC Genomics Workbench 3.6.1将所得序列进行拼接。登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具将测序结果与GenBank中注册基因序列进行同源性比对，根据本领域种类鉴定标准，以种间序列相似性≥99%，结合不同来源等生态学特征，判定为同一虫种。应用MEGA6.06软件，邻接法Neighbor-Joining，Kimura 2-parameter model，bootstrap 1000构建系统发育树，对获得的阳性样本序列进行遗传进化分析。

2 结果

2.1 梨形虫检测

牛、羊血液DNA的PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，以出现约1 600 bp大小的条带、产物测序成功者为阳性。共检出阳性207头，总阳性率27.31%。其中羊检出阳性58头，阳性率为13.58%；牛检出阳性149头，阳性率为45.02%；梨形虫分布在腾冲市各乡镇，以周边山区为主(见图1，表1)。,有6个乡镇的羊血检出阳性，阳性率高低依次为荷花镇(66.67%)、滇滩镇(45.00%)、明光镇(28.57%)、界头镇(6.25%)、芒棒镇(4.76%)，全部乡镇的牛均检出阳性，阳性率在6.67%～100%之间，其中猴桥镇某养殖户的20头牛均检出阳性。

表1 腾冲市不同乡镇牛羊犁形虫检测结果 头

2.2 感染梨形虫的种类

本调查检出巴贝斯虫和泰勒虫两属共13 种，均为蜱传血液原虫，包括8种泰勒虫：吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)、环形泰勒虫(T.annulata)、水牛泰勒虫(T.buffeli)、东方泰勒虫(T.orientalis)、瑟氏泰勒虫(T.sergenti)、绵羊泰勒虫(T.ovis)、附膜泰勒虫(T.velifera)和一种新的未命名泰勒虫；5种巴贝斯虫分别是：狍巴贝斯虫(B.capreoli)、猎户巴贝斯虫(B.venatorum)、双芽巴贝斯虫(B.bigemina)、牛巴贝斯虫(B.bovis)、微小巴贝斯虫(B.microti)。

2.2.1 巴贝斯虫感染情况

共检出37份、5种巴贝斯虫。其中羊感染狍巴贝斯虫(1例)、猎户巴贝斯虫(3例)，牛感染双芽巴贝斯虫(21例)、牛巴贝斯虫(10例)、微小巴贝斯虫(1例)、猎户巴贝斯虫(1例)，共4种33例。从地区分布来看，双芽巴贝斯虫从7个乡镇的牛中检出，牛巴贝斯虫在6个乡镇检出，狍巴贝斯虫、微小巴贝斯虫、猎户巴贝斯虫各在1个乡镇检出。检出种类最多的是中和镇，共检出4种13例，阳性率最高是腾越镇10.45%(7/67)。不同牛羊个体来源的同种巴贝斯虫约1 600 bp基因序列差异在0.0和0.015之间。21个双芽巴贝西虫序列遗传距离为0.0-0.004不等，在黄牛和奶水牛中检出的双芽巴贝西虫序列存在更大差异。

2.2.2 泰勒虫感染情况

共检出170头共计8种泰勒虫。其中羊感染的54头有吕氏泰勒虫(51例)、绵羊泰勒虫(2例)和附膜泰勒虫(1例)；牛感染的116例有环形泰勒虫(2例)、水牛泰勒虫(53例)、东方泰勒虫(51例)、瑟氏泰勒虫(4例)、吕氏泰勒虫(2例)、附膜泰勒虫(2例)和未命名泰勒虫(2例)。不同牛羊个体来源的同种泰勒虫约1 600bp基因序列差异在0.0和0.020之间。

牛和羊都有感染的有吕氏泰勒虫和附膜泰勒虫。羊感染吕氏泰勒虫分布于6个乡镇；牛以水牛泰勒虫(53/170)、东方泰勒虫(51/170)为主，前者除曲石镇以外，后者除明光、固东和曲石以外，其它乡镇均有分布。感染率最高的猴桥镇某养殖场的20头牛全部均有感染，包括3种泰勒虫。

2.3 感染梨形虫序列分析

测序成功的阳性样本，挑选代表性序列在NCBI网站分别注册序列号。所得巴贝斯虫序列分别与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较，检出的5种巴贝斯虫与相应巴贝斯虫虫种的同源性均>99%。以间日疟原虫(Plasmodiumvivax，JQ627158)为外类群建系统进化树分析，结果表明，山羊中检出的狍巴贝斯虫，与德国、法国、意大利等地在鹿和马中检出的聚在同一分枝：在山羊和水牛中检出的猎户巴贝斯虫，与在甘肃白牦牛中检出的序列、黑龙江、新疆、蒙古等地的人群和蜱中检出的序列聚在一个大簇，但分别独处一个小分枝；在黄牛和奶水牛中检出的双芽巴贝斯虫，与国内多地检出的序列同源性>99%；在黄牛和水牛中检出的牛巴贝斯虫，同源性>99%，进化分析分为2小簇，一部分与国内家畜中检出的序列聚得较近，一部分与南非、美国等地从牛和鹿中检出的序列聚得较近；而在水牛中检出的微小巴贝斯虫，与在国内多地的患者和鼠类检出的序列同源性在99%以上，聚在同一分枝。见图2。以上结果表明，本次检出的不用巴贝斯虫均能进行系统的分类，但存在自身的独特特点。

梨形虫以微小巴贝斯虫(Babesiamicroti,AB242176.1) 为外类群建系统进化树，各虫种均与参考序列聚在各自的小分枝里。2份牛血中检出的吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)与羊血中检出的序列同源性较高，聚在一起。一种新的未命名的泰勒虫2份样本(TC-B-562，567)与韩国和国内检出的序列同源性最高，和水牛泰勒虫聚在一簇，但独处一个分枝； TC-B-296序列则与日本岩手县报道的在台湾鬣羚检出的泰勒虫序列同源性最高(>99%)，最接近的为吕氏泰勒虫。这些虫种是否为一个单独的种或亚种，还有待研究。见图3。

●为本研究检出的序列

图2 基于巴贝斯虫18S rRNA基因构建的系统发育树

●为本研究检出的序列

图3 基于泰勒虫18S rRNA基因构建的系统发育树

3 讨论

腾冲市下辖18个乡镇(7个乡、11个镇)，畜牧业是当地农村的重要产业，市内还有腾冲马、槟榔江水牛、明光小耳猪、腾冲雪鸡、腾冲绵羊等优良地方畜禽品种和遗传资源。梨形虫是一类严重影响畜牧业发展的蜱传寄生虫病，为了解该病在我市家畜中的感染情况，本次调查共在11个乡镇采集牛、羊血样进行调查。既往，血液原虫病多采用血涂片染色镜检法，但较为费时，且不同发育时期的不同虫种形态特征较为复杂，对检测人员的要求较高，容易漏检，但形态学检测是诊断寄生虫病的金标准。分子生物学检测敏感性和特异性较高，尤其是带虫量少时，较血涂片检出率高，还能对感染虫种进行定种鉴定[1]。因而本次调查采用扩增梨形虫18S rRNA基因1 600 bp片段的方法，根据扩增到目的片段的测序结果进行虫种鉴别。因此，如将形态学和分子生物学检测技术相结合，将有利于提高检出率和准确率。本研究暂运用分子生物学方法，调查我市牛羊感染梨形虫的情况。在758份样本中检出阳性并测序成功207份，总阳性率为27.31%。其中羊的感染率为13.58%(58/427)，牛的感染率为45.02%(149/331),所有乡镇的牛均存在感染，6个乡镇的羊检出阳性。阳性集中在猴桥镇、滇滩镇、明光镇、腾越镇和中和镇。我国家畜中感染梨形虫较为普遍，据调查在全国12个省市、自治区均有分布，家畜和野鼠均有感染[2-5]。相关文献报道，我国南方贵州、广东、重庆的羊泰勒虫感染率分别达46.80%、90.9%、12.7%[6]，吉林省部分地区为28.08%[7]，新疆库车县羊梨形虫感染率高达52.79%[8]。本次调查表明当地养殖牛羊中流行梨形虫病，以牛感染泰勒虫为主，分布广泛。

目前，全世界报道的哺乳动物巴贝斯虫共67种，泰勒虫有13种，近年不断有新种被证实和发现。其中牛感染泰勒虫主要有 5种:环形泰勒虫(T.annulata)、突变泰勒虫(T.mutans)、瑟氏泰勒虫(T.sergenti)、小泰勒虫(T.parva)、中华泰勒虫(T.sinensis)[9]；巴贝斯虫主要有5种：双芽巴贝斯虫(B.bigemina)、牛巴贝斯虫(B.bovis)、大巴贝斯虫(B.major)、卵形巴贝斯虫(B.ovata)和东方巴贝斯虫(B.orientalis)。羊感染泰勒虫有6种：莱氏泰勒虫(T.lestoquardi)、隐藏泰勒虫(T.recondita)、分离泰勒虫(T.separata)、尤氏泰勒虫(T.uilenbergi)、吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)和绵羊泰勒虫(T.ovis)；巴贝斯虫有9种：莫氏巴贝斯虫(Babesia.motasi)、绵羊巴贝斯虫(Babesia.ovis)、微小巴贝斯虫(Babesiamicroti)、双芽巴贝斯虫(Babesiabigemina)、分歧巴贝斯虫(Babesiadivergens)、泰氏巴贝斯虫(Babesia.taylory)、粗糙巴贝斯虫(Babesia.crassa)、叶状巴贝斯虫(Babesia.foliata)和狍巴贝斯虫(Babesiacapreoli)等[10]。我国牛、羊、马、犬等家养已发现9种巴贝斯虫和7种泰勒虫[11]。其中尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫是我国学者发现并命名的新虫种[12]。一般认为，莱氏、尤氏、吕氏泰勒虫具有强致病性，属于恶性泰勒虫，环形泰勒虫、小泰勒虫对牛也有高度致病性，易致易感动物患病甚至死亡。其它为弱毒或无致病性，属于温和型泰勒虫。同时，巴贝斯虫的致病性主要还取决于宿主的免疫状态。部分虫种如微小巴贝斯虫(Babesiamicroti)、分歧巴贝斯虫(Babesiadivergens)、猎户巴贝斯虫(Babesiavenatorum)、邓肯巴贝斯虫(Babesiaduncani)等可对人致病，一般认为泰勒虫不感染人。根据检测到的核苷酸序列比对和遗传进化分析，本次调查共检出巴贝斯虫和泰勒虫两属共13 种蜱传血液原虫：5种巴贝斯虫和8种泰勒虫。优势虫种为吕氏泰勒虫、水牛泰勒虫、东方泰勒虫和双芽巴贝斯虫。羊以感染吕氏泰勒虫为主，牛以水牛泰勒虫、东方泰勒虫和双芽巴贝斯虫为主，有对家畜致病性较强的虫种，也有对人有致病性的虫种。一些种类如类猎户巴贝斯虫、狍巴贝斯虫是尚不明确其致病性的。在牛中检出2例吕氏泰勒虫，尚需进一步验证。同时，通过18S rRNA核苷酸序列比对和遗传进化分析的方法来确定虫种，还存在一些不足，如能结合P32、COI、28S rDNA等其它目的基因的检测，将更有利于虫种的确认及病原体溯源等研究。

云南省是我国记录蜱种最多的省份，也是虫媒传染病的高发区和主要流行区。腾冲市位于云南省西南部，境内多高山，海拔高差显著(930～3 780 m)，横贯境内的高黎贡山是横断山脉的组成部分，森林覆盖率较高，野生动物丰富。本市坝区(河谷)面积占总面积的16%，山区、半山区面积占84%，加之气候湿润，降雨量丰沛，适合蜱虫生长。由于山区、半山区地理条件的限制，养殖业是当地农业人口的主要经济来源，近年来规模养殖也得到快速发展。既往相邻地区大理、梁河等地有牛、羊、猪等动物巴贝斯虫病暴发流行的报道[13-15]，近年有当地居民感染巴贝斯虫的病例报道[16]，本市医疗机构病人调查也反映出[17]，家中饲养家畜尤其是牛染蜱常见。本次从家畜中检出多种梨形虫，包括对人致病的微小巴贝斯虫、未命名的新种虫种、对人致病性较强但序列存在差异的猎户样巴贝斯虫。有强致病性的，也有温和型的。虽然阳性率与国内其它地方相比并不算高，但在同一地区检出如此多种类梨形虫的情况较为少见。这与腾冲市具有良好的自然环境、较高的生物多样性特征密切相关，尤其家畜放养，增加了通过媒介蜱将病原体从野生动物向家畜传播的机会。随着养殖业的发展，跨地区运输交易频繁等可导致疾病随之传播，一旦流行则很难根除，成为梨形虫病的自然疫源地。而蜱虫携带和传播的病原体不仅有梨形虫，还包括病毒、细菌、立克次体等。提示在发展畜牧业的同时，需加强动物圈舍、动物体表的灭蜱，输入家畜的检疫，以及从业人员提高防范意识，避免被蜱虫叮咬。兽医应加强对梨形虫病的认识，及时治疗病畜，控制疾病传播，从而降低梨形虫病及其它蜱传疾病对当地人群健康和畜牧业发展带来的危害。