RP-HPLC法测定复方布他磷注射液中布他磷含量的方法学研究

刘元元，张丽芳，张崇，车传燕，王艳玲,2，苗晋锋，邓旭明*

(1. 吉林大学动物医学学院，吉林 长春 130062；2. 青岛蔚蓝生物股份有限公司，山东 青岛 266111；3. 上海兽药研究所，上海 201203；4. 安徽科技学院，安徽 滁州 233100；5. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

布他磷(butafosfan)是一种白色结晶性粉末，无臭的氨基丙磷化合物，极易溶解于水，是由德国Bayer公司于1958年开发生产的一种有机磷补充剂，具有促进代谢、增强免疫以及抗应激等功效[1-2]。课题组对该药及其制剂进行了研制开发，为确保新药质量，对复方布他磷注射液中布他磷含量的测定方法进行了系统研究[3]。布他磷的化学结构不含共扼双键结构，因此，本类化合物无紫外吸收[4-5]。考虑到示差折光检测器是通用型检测器，本研究采用液相色谱示差折光检测法进行复方布他磷注射液中布他磷含量的测定，结果显示该方法具有较高的专属性和灵敏度，为国内外首次报道。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(Waters e2695型 )，检测器为Waters 2414型示差折光检测器； C8色谱柱(粒度：5 μm，4.6×250 mm，SunFireTM)。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。复方布他磷注射液(青岛蔚蓝生物股份有限公司研制)；布他磷对照品(青岛蔚蓝生物股份有限公司研制，含量：99.8%)。

1.2 色谱条件

色谱柱：C8(5 μm，4.6×250 mm，SunFireTM),流动相：甲醇：0.2% 磷酸水溶液(8∶92,V∶V)；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；运行时间：20 min。

1.3 溶液的制备

供试品溶液的制备：精密量取2 mL，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液 1mL，置10 mL量瓶中，用流动相溶液稀释至刻度，摇匀。

对照品溶液的制备：取对照品约0.2 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液1 mL，置10 mL 量瓶中，用流动相溶液稀释至刻度，摇匀。

测定方法：分别取对照溶液和供试品溶液各10 μL 注入液相色谱仪中，记录色谱图。外标法以峰面积计算。

1.4 方法学考察

依据《兽用化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》，对研制的复方布他磷注射液进行了系统适应性试验、专属性、线性、精密度、回收率、溶液稳定性考察。

1.4.1 系统适应性试验与专属性

取布他磷对照品溶液和供试品溶液进样，分别记录液相色谱图，计算理论塔板数、布他磷与相邻的杂峰布他磷氧化物的分离度，考察该方法的系统适应性及专属性。

1.4.2 线性考察

取布他磷对照品0.2 g，精密称定，置25 mL 量瓶中，用流动相溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取0.8、0.9、1.0、1.1和1.2 mL分别置10 mL量瓶中配制成一系列浓度的溶液，分别进样10 μL，将测得的布他磷的峰面积对样品浓度进行线性回归，并绘制标准曲线。

1.4.3 精密度、回收率、中间精密度

取布他磷对照品溶液，连续重复进样6针，记录布他磷主峰面积，计算RSD，得中间精密度。分别精密称取布他磷原料80、100和120 mg，每个称样量平行三份共9份，并加入处方量的维生素B12及其它辅料，分别置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取2 mL置10 mL量瓶中，用加流动相稀释至刻度，制备得到三种浓度的供品溶液。另取布他磷对照品0.2 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL 置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取上述两种溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算回收率。取批号20120423的复方布他磷注射液样品5份，由两人按供试品溶液制备项操作，按测定法进样计算布他磷峰面积及RSD，得中间精密度。

1.4.4 溶液的稳定性

取批号20120423的复方布他磷注射液样品溶液，在前期试验的基础下，分别在0、0.5、22和24 h进样测定，计算布他磷色谱峰面积，从而考察检测样品常规放置24h的稳定性。

1.4.5 样品含量测定

取3批本品样品，按供试品溶液制备项操作，按样品含量测定法测定布他磷标示含量。

2 结果

2.1 系统适应性试验和专属性

通过对复方布他磷注射液主成分及降解产物布他磷氧化物进行HPLC分离检测，结果显示布他磷的理论塔板数大于5 000。由图1、图2、图3可知本方法条件下布他磷与相邻的杂峰布他磷氧化物的分离度>1.5，表明本方法的系统适应性和专属性良好。

图1 复方布他磷注射液系统适应性色谱

图2 布他磷氧化物(A)和布他磷(B)的色谱

图3 布他磷氧化物(上)和布他磷(下)的色谱

2.2 线性考察结果

线性结果表明，布他磷浓度在0.64～0.96 mg/mL范围内有良好的线性关系(见表1和图4)。回归系数r2=0.999 2。

表1 布他磷线性测定结果

浓度/(mg·mL-1)峰面积0.640 6388 7800.720 7435 9960.800 8482 6480.880 9534 9770.961 0577 114

图4 布他磷浓度-峰面积标准曲线

2.3 精密度、回收率、中间精密度和溶液稳定性

精密度结果见表2，本法的精密度良好。回收率测定结果见表3，本方法对高、中和低三种浓度下布他磷的回收率均大于99%，表明回收率良好。中间精密度结果见表4，RSD=0.18%，表明该方法中间精密度良好。溶液的稳定性测定结果见表5，结果表明布他磷溶液在24 h内稳定性良好。

综上方法学各参数的考察，说明本方法完全能满足检测要求。

表2 布他磷精密度结果

序号峰面积(mAu∗s)平均值(mAu∗s)RSD/%148506324831293481809448398954818226482633483 074.20.26

2.4 样品测定结果

复方布他磷注射液三批供试品结果(表6)表明，样品中的布他磷含量测定结果均在标示含量的95.0%～105.0%，符合规定。

表3 布他磷回收率测定结果

序号加样量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD180.480.3899.97280.579.8899.22380.480.3199.8999.690.414100.9100.5099.605100.7101.19100.486100.3101.13100.82100.30.637119.6121.00101.178120.4120.75100.299120.0120.44100.36100.60.48

表4 布他磷中间精密度试验结果

序号布他磷峰面积(mAu∗s)平均峰面积(mAu∗s)RSD(%)1475 3712476 4293475 2714477 3235475 850476 048.80.18

表5 布他磷溶液稳定性测定结果

时间/h布他磷峰面积(mAu∗s)平均峰面积(mAu∗s)RSD(%)0476 0190.5475 37122474 75324482 439477 1450.13

表6 复方布他磷注射液中布他磷含量测定结果

批号201204232012042520120427布他磷标示含量/%100.898.5103.2

3 讨论与小结

2011版《进口兽药质量标准》中复方布他磷注射液中布他磷含量测定方法是采用的非水电位滴定法，该方法的原理就是利用布他磷显弱酸性的化学性质，以强碱性的四丁基氢氧化铵作为滴定剂，以甲醇和N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，进行电位滴定来测定布他磷的含量[4]。考虑到本研究的复方布他磷注射液的处方中含有乙酸这一酸性物质，如采用进兽药质量标准中的布他磷含量测定方法方法，必定影响检测结果的准确性。因此，本研究通过试验摸索，采用了液相色谱法进行布他磷含量测定，由于布他磷紫外无吸收[5]，不能用紫外检测器进行检测，因此采用了示差折光检测器。

该方法将布他磷及有关物质布他磷氧化物成功进行了分离，专属性及系统适应性良好，可同时满足复方布他磷注射液中布他磷的含量测定及有关物质的测定。本研究主要进行了主成分布他磷含量测定的方法学研究，系统考察了线性、精密度、回收率、中间精高密度、测定样品放置稳定性等，结果表明，该方法简便、准确、精密度高、重复性好，可用于复方布他磷注射液中布他磷含量的测定，为复方布他磷注射液有关物质的测定及其方法学研究奠定了基础。