1例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系基因突变分析

郭跃丽，孔万仲，万菁，蔡文品，陈孟权，奚经巧(温州市中医院检验科，浙江温州325000)

遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症是一种罕见的常染色体遗传性出血性疾病，常见于近亲婚配的家族。大部分患者主要表现为黏膜出血，例如鼻出血、牙龈出血、瘀斑等，女性患者可表现为月经量增多[1-2]。其临床表现具有高度异质性，出血严重程度与基因突变位点、突变数量、突变类型等密切相关[3]。因此，分析F7基因突变对遗传性FⅦ缺陷症具有重要意义。本研究对1例近亲婚配的遗传性FⅦ缺陷症患者进行凝血指标检测与基因分析，初步探讨其分子发病机制。

1 资料与方法

1.1家系资料 先证者，男，48岁，汉族，浙江乐清人，因“无故反复性鼻出血”1 d于2018年3月16日就诊于我院五官科。凝血常规检查发现，血浆凝血酶原时间(PT)延长(为31.2 s)，FⅦ活性(FⅦ:C)、FⅦ抗原(FⅦ:Ag)均降低(分别为4%和6%)，其他凝血指标均无异常，肝、肾功能正常，平素无明显自发出血症状。其父母为姑表近亲婚配，家系其他成员均无自发出血症状。该先证者的家系图见图1。

图1 1例遗传性FⅦ缺陷症先证者的家系图

1.2健康人对照 收集150例体检健康者，其中男性86例，女性64例，年龄21～48岁，无肝、肾功能异常，无出血及血栓史，无抗凝剂用药史，女性未口服避孕药。建立本次实验室凝血表型指标的参考区间。所有研究对象均知情同意。

1.3标本采集与处理 采集研究对象空腹静脉血标本2.7 mL，用0.109 mol/L枸橼酸钠溶液抗凝。标本3 000 r/min离心15 min后，取上层乏血小板血浆用于各凝血指标的检测，2 h内完成；下层血细胞于-40 ℃冻存，待用于基因组DNA的抽提。

1.4凝血指标检测 PT、凝血活酶时间(APTT)的检测采用一期凝固法；纤维蛋白原(Fib)的检测采用Clause法；FⅦ:C、凝血因子Ⅹ活性(FⅩ:C)、凝血因子Ⅴ活性(FⅤ:C)和凝血因子Ⅱ活性(FⅡ:C)均采用基于PT的一期凝固法检测。以上均采用Stago STA-R全自动血凝仪及其原装配套试剂(法国STAGO公司)严格按照试剂说明书完成检测。

1.5外周血基因组DNA提取 选用酚-氯仿法提取先证者及其家系成员的外周血细胞基因组DNA，并用DU800核酸蛋白分析仪检测所提取基因组DNA的浓度和纯度。所有步骤均按照酚-氯仿法基因组DNA提取试剂盒说明书进行，基因组DNA提取试剂盒由北京天根生物公司提供。

1.6引物及PCR扩增 根据F7基因序列(GenBank J02933)，用Primer Premier 5.0软件分别设计11对引物以覆盖F7基因的所有外显子、5′和3′非翻译区序列、侧翼，引物序列及PCR扩增条件参见文献[3]。引物由上海桑尼生物公司合成。

1.7PCR产物测序 PCR产物割胶后送上海桑尼生物工程公司纯化后用ABI3730XL型测序仪(美国Applera公司)测序。通过Chromas软件与美国NCBI 基因库所公布的F7基因序列(GenBank GI180333和J02933序列)以及F7突变数据库(http://europium.csc.mrc.ac.uk)在Blaster软件上(http:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行比对，查找基因突变的位点，发现突变位点后，再利用反向测序予以证实。明确先证者基因突变的位点后，利用PCR扩增其他家系成员的相应突变位点区域并进行测序分析。

1.8生物信息学技术分析 采用ClustalW软件分析氨基酸突变位点保守性，采用PolyPhen-2、SIFT软件分析氨基酸突变前后生物信息学特性，采用Swiss-pdb Viewer软件分析FⅦ蛋白模型野生型和突变型局部空间构型及分子间作用力的变化。

2 结果

2.1先证者及其家系成员凝血指标水平 先证者PT明显延长；FⅦ：C和FⅦ：Ag较健康人对照降低。先证者母亲、父亲、大姐、二姐和哥哥PT均稍延长；FⅦ：C和FⅦ：Ag均下降至健康人对照的一半左右，家系成员的其他凝血指标均无异常(表1)。

表1 先证者及其家系成员主要凝血指标检测结果

2.2先证者及其家系成员基因分析 先证者F7基因(GenBank GI180333)第8外显子存在c.1224 T>G纯合错义突变导致p.His348Gln，其母亲、父亲、大姐、二姐和哥哥均存在c.1224 T>G杂合错义突变，其外甥女为野生型(图2)。

注：A，先证者c.1224T>G纯合子突变;B，母亲c.1224T>G杂合子突变；C，正常序列；箭头示突变位置。

图2遗传性FⅦ缺陷症家系第8号外显子测序结果

2.3生物信息学技术分析 用ClustalⅩ-2.1-win软件对人类和 NCBI 数据库中提供的其他9种同源性物种F7基因氨基酸序列进行多重比对。图3中箭头所指为FⅦ的348位氨基酸His，目标线全部为H，表明该氨基酸在同源物种中具有高度保守的特性。

图3 不同物种间FⅦ的His348的氨基酸序列比对

分别用PolyPhen-2和SIFT在线生物信息学软件对FⅦ突变后蛋白质通过评分预测功能：His348Gln的PolyPhen-2预测结果为1.000，提示“可能是有害的”；SIFT预测结果为0.32，提示“影响蛋白质功能”。用Swiss-Pdb Viewer version软件对FⅦ His348Gln突变前后的蛋白质结构进行模型分析：野生型蛋白质的分子模型结构中His348与Thr359和Gly360之间存在5条氢链，当亲水性的Gln348取代碱性的His348时芳香环消失，Gln348与Thr359之间少了1条氢链。见图4。

注：A，野生型；B，His348Gln突变型；绿色虚线表示氢键。

3 讨论

遗传性FⅦ缺陷症是一种常染色体隐性遗传性出血性疾病，其临床表现与血浆FⅦ：C无明显相关性，重症患者多为影响基因结构和功能的纯合或者复合杂合突变所致，其FⅦ：C通常低于2%；而单一杂合突变患者的FⅦ：C一般不低于30%，几乎无临床症状[4]。大约有1/3的FⅦ缺陷症患者可终身无出血表现，这些患者往往是在家族史研究或者止血试验筛查时被发现[5]。本研究家系中的先证者凝血常规筛查发现PT延长、FⅦ：C和FⅦ：Ag减低，诊断为FⅦ缺陷症。通过先证者和家系成员的基因分析发现：先证者存在F7基因c.1224T>G纯合子错义突变，分别遗传自携带c.1224 T>G杂合错义突变的父亲和母亲。先证者F7基因第8号外显子存在纯合错义突变c.11482 T>G，导致p.His348Gln。家系中母亲、父亲、大姐、二姐和哥哥均存在c.1224 T>G杂合错义突变，其FⅦ：C和FⅦ：Ag均约下降至健康人对照的一半，与国内外相关报道[6-7]一致。

国际上关于F7基因His348Gln突变位点的第1个病例由日本Katsumi教授报道[8]，在对该突变位点进行体外表达研究发现，该突变可改变FⅦ的空间结构，导致其分泌障碍，致使血浆中的FⅦ:C及FⅦ：Ag均降低，表现为交叉反应物质阴性(CRM-)，表明His348Gln纯合突变会影响FⅦ的分泌功能。Ding等[9]研究了其致病机制，亦证实His408(348)Gln 双杂合突变影响FⅦ的合成。本研究家系发现的His348Gln突变位点用Swiss-Pdb Viewer version 软件对突变前后的蛋白质结构进行模型分析，结果显示：野生型蛋白质的分子模型结构中His348与Thr359和Gly360之间存在5条氢链，当亲水性的Gln348取代碱性的His348时芳香环消失，Gln348与Thr359之间缺失了1条氢链。FⅦa与组织因子(TF)结合的活化位点在Met306[10]，将该位点的Met进行氨基酸替换后，可打破原有的正常氢链结构，从而阻断TF对FⅦ的活化过程。本研究报道的His348位于Met306附近，蛋白质结构分析显示突变后可导致原有氢链数量的减少。因此我们推测该突变可能也会影响TF对FⅦ的活化过程，是否由于TF-FⅦa复合物在不同情况下存在不同的生理活性，从而使F7基因即使具有相同的突变位点，但若还有其他影响TF-FⅦa复合物形成的因素存在的情况下，仍可导致不同的临床表现。