VAP+技术在高三酰甘油血症患者血浆LDL-C和LDL-P检测中的应用*

梁纯子，朱满，伍仕敏，涂建成(1.武汉大学检验系，武汉 40071；2.武汉大学中南医院检验科&基因诊断中心，武汉 40071；.长江航运总医院&武汉脑科医院检验科，武汉400)

脂质异常与动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，AsCVD)密切相关，低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)水平升高是心血管事件发生的独立危险因素；而通过他汀类药物降低LDL-C水平减少心血管事件的发生率是目前防治指南的基础[1-2]。近期更有研究证实低密度脂蛋白颗粒(low-density lipoprotein-particle，LDL-P)直接参与动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)的病理进展，是冠心病(coronary artery disease，CAD)的独立危险因素[3]。因此，作为AsCVD预防、评估、诊断和干预极为重要的靶值，LDL-C和LDL-P结果的真实性倍受关注。高三酰甘油血症(hypertriglyceridemia，HTG)是中国最常见的血脂异常，通常伴随多种代谢异常，如肥胖、代谢综合征、2型糖尿病和某些遗传型脂质紊乱等[4]。由于此类患者普遍存在不寻常的脂蛋白分布，采用临床实验室常规的血脂生化方法如均相法和Friedwald公式间接法检测LDL-C/LDL-P有较大的局限性，得到的数据与临床实际相符度不高，影响后续诊疗效果，需要予以改良。垂直梯度离心法血脂检测技术(vertical auto profile lipid panel plus，VAP+)原理独立于公式法，血浆中高三酰甘油(triglycerides，TG)水平对其影响较小，在HTG患者血脂检测科学性和准确性中具有一定的优势。因此，本文将综述该方法的技术原理和特点，并评价该方法在HTG患者血脂检测中的应用。

1 VAP+血脂检测技术原理

VAP+是一种用于定量测定血浆脂蛋白亚组分、脂蛋白胆固醇含量及脂蛋白颗粒浓度的自动化检测体系[5]。 VAP+方法学上参考经典的超速离心法，在特殊的梯度介质溶液中，垂直超速离心将血浆脂蛋白按密度大小进行连续稳定的分层；分别为极低密度脂蛋白(very-low-density lipoprotein，VLDL)、 LDL各亚型、中间密度脂蛋白(intermediate-density lipoprotein，IDL)、脂蛋白残粒(remnant-like lipoprotein particle，RLP)、脂蛋白(a)[lipoprotein (a)，Lp(a)]和高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)；分离后的脂蛋白依次连续通过离心管底部，按分层顺序流出并与相应的胆固醇检测试剂混合反应，随后探头记录连续反应的光谱变化；根据出峰时间和面积，专用分析软件基于大量积累的人群数据，区分每一类型的脂蛋白，最终计算该类脂蛋白颗粒对应的胆固醇含量。

VAP+可以直接检测出的脂蛋白亚组分胆固醇包括HDL、LP(a)、LDL、IDL 和VLDL及亚型(HDL2～3、LDL1～4、VLDL1～3)(图1)。同时，血浆样品中LDL-P可通过特殊的缓冲分离液提取出来，利用激光散色原理获取颗粒平均体积大小，计算出LDL-P型别和浓度：A型LDL-P，大而轻LDL颗粒为主；B型LDL-P，小而密LDL颗粒(small and dense-LDL, sd-LDL)为主；AB中间型LDL-P[5-6]。

图1 VAP+血脂检测技术原理和流程示意图

2 HTG患者中Friedwald公式法LDL-C检测的局限性

LDL主要负责将胆固醇由肝脏运送到全身组织，LDL-C水平在缺血性心脏病发生相对危险和绝对危险中的上升趋势及程度与总胆固醇水平一致。目前，包括美国国家胆固醇教育计划(national cholesterol education program，NCEP)在内，国内外多个AsCVD的防治指南均以LDL-C作为实验室目标项目进行疾病的风险控制，认为LDL-C是评价As进展最重要的无创伤性指标。例如《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》直接以LDL-C水平为主要指标区分 AsCVD高危人群[7-8]。但实验室中LDL-C检测值的真实性受到多种因素的影响，水平低估常导致AsCVD漏诊、风险性误判和用药失误。在Framingham心血管病研究中，80% CAD患者的血脂处于正常范围，按目前的风险等级应划分到“低危人群”[9]，与患者心血管病变程度明显不相符。

临床实验室常用的LDL-C检测方法有两大类：基于Friedwald公式的间接计算法和基于特异性试剂封闭的匀相法。考虑到各厂家封闭试剂成分不同，变异度较大，本文不做延伸，仅对比讨论Friedwald公式间接法与VAP+检测LDL-C的优劣[10]。

Friedwald公式是指在空腹情况下，即外周血中没有乳糜微粒(chylomicrons, CM)时：[TC]=[LDL-C]+[HDL-C]+[VLDL-C]，因此，[LDL-C]=[TC]-[HDL-C]-[VLDL-C]，另外，[VLDL-C]=[TG]/5，最终公式：[LDL-C]=[TC]-[HDL-C]-[TG]/5。如公式所示，LDL-C水平与标本中的TG、CM及VLDL浓度直接相关。在健康人群正确空腹(>12 h)的情况下，实验室基于Friedwald公式，利用酶和底物迅速在血浆中测得LDL-C能够反映其真实水平；但在糖尿病、心脏病、As和代谢综合征等影响下的HTG患者中，此方法计算得出的LDL-C水平低于真实值[11]。

因此，早在2002年NCEP就提出新的LDL-C直接检测方法学的要求，尤其患者存在HTG的情况下(TG>200 mg/dL)。而根据目前的检测现状，NCEP ATP Ⅲ指南建议当TG>200 mg/dL时，非HDL-C应该取代LDL-C作为新的二级治疗干预的指标[12]； 当TG水平高于250 mg/dL时，患者外周血标本的脂质检测项目包括LDL-C在内需要通过其他方法学进一步做更详细的分析[13]。临床普遍将高危人群降LDL-C的目标值为低于100 mg/dL，而Friedwald公式并不适用于这一类患者LDL-C的检测(有关研究认为会造成近18.5%的误差)[11,14-15]；近期研究建议将AsCVD高危患者LDL-C水平控制在70 mg/dL以下，这一水平更是远远超过了公式法的适用范围。因此，单纯以公式法为基础的LDL-C实验室检测存在极大隐忧。

在2012年一项涉及130万人的调查研究[16]中，以VAP+为检测参照，Friedwald公式法得出的LDL-C水平和AsCVD风险值存在偏差。即当TG水平高于参考区间(150～400 mg/dL)时，约25%～60%患者的LDL-C低于真实值，风险被低估；与此同时，在TG水平正常时，仍有12%～20%的患者应划分到更高的风险等级。这些偏差会对TG代谢紊乱患者的心血管疾病风险和干预效果产生明显的负面影响[17]。

LDL-C水平检测不准确还会影响到药物与临床结果之间的对应关系。大量的综述和meta分析显示，Friedwald公式法获得的LDL-C会造成部分临床试验研究对象的选择性偏差[12]。多个他汀类降脂药物的研究(包括WOSCOP,CARE, HPS, A to Z, ASCOT-LLA, LIPID和 4S等)完全排除TG水平高于200～250 mg/dL的患者，部分原因是此类患者往往需要另外再单独检测LDL-C水平从而增加试验成本。因此，临床上很大部分血脂异常(LDL-C、TG均高)的患者被排除在降脂药物的三期临床试验之外，由此得出的试验结论和临床应用可信度也随之降低。

VAP+血脂检测的核心原理是超速离心，特点是脂蛋白颗粒的原始状态保存，从而直接检测脂蛋白中的胆固醇而无需公式法的换算。实际上，这也是血脂检测研究最经典的方法，但之前往往需要24 h的长时间离心，无法满足临床快速检测的要求。VAP+通过特殊的缓冲液和离心体系有效减少了离心时间(从24 h减少到1 h)；在检测内容上参照NCEP ATP Ⅲ指南，明确LDL-C和非HDL-C的目标值；因此，VAP+检测的LDL-C相对而言较为真实地反映出患者外周血中的脂质状态，且不受饮食限制和HTG的影响。在美国等多个地区推荐其用于胰岛素抵抗、代谢综合征、糖尿病等复杂性血脂异常患者的检测，从而正确评估其心血管相关疾病的风险或降脂药物的合理选择[18]。

3 LDL-P的检测

血浆中的TG主要存在于 CM、VLDL及其残粒(remnants)中。当外源性食物摄取(CM)和肝脏合成(VLDL)增多导致血浆TG上升时，胆固醇酯酶活性增加会促进VLDL中的TG转移至HDL和LDL中，颗粒中胆固醇比例减少。在肝脂酶和LPL的作用下HDL和LDL中的TG进一步水解，最终形成体积小密度高(small and dense，sd-)的HDL和LDL颗粒。小而密的HDL颗粒易从肾脏排除，造成保护性HDL-C水平下降；但小而密的LDL颗粒(small and dense LDL-P，sd-LDL-P)在血管中停留半衰期明显延长，浓度升高。滞留的LDL-P更易穿过血管壁内皮被氧化，促进As进展[19-20]。临床证据显示40%～50%的确诊CVD患者血浆sd-LDL-P浓度明显升高[21]；与健康人群相比，sd-LDL升高的人群患CAD和心肌梗死的风险分别增加4和6.9倍，而高总胆固醇血症和高LDL-C也仅仅增加该人群2倍的风险；且多个前瞻性研究和药物临床试验也证实降低sd-LDL-P能有效缓解As的进展[22]。

HTG导致高sd-LDL-P，部分解释了虽然中国高LDL-C的人群少，但CAD的发病率与西方国家相持不下的原因。2010年中国流行病学调查显示，在97 209例18岁以上居民中高LDL-C血症的患病率仅为2.1%，而HTG的患病率为11.3%；近半数心脏病急性发作的患者血浆LDL-C水平仍在正常范围；在早发缺血性心血管病的患者中，只有25%出现LDL-C升高，58%的患者LDL-C水平仍低于参考区间下限(130 mg/dL)[23]。DYSIS中国研究报告覆盖6个大区、122家医院、17个省，结论是25 317例服用他汀3个月以上患者，仍有高达47.6%的患者伴随HTG[24]。

sd-LDL-P被部分专家称为血管中的“雾霾”，生动说明体积小但致密的sd-LDL比大而轻的LDL更有危害性，是目前CVD风险评价最佳的预测因子。斯坦福的心脏风险干预计划报告在LDL-C水平正常的人群中LDL-P密度更适合预测斑块发展，是CAD和脑卒中的独立风险预测因素[25]；波士顿大学开展的回顾性调查发现，在3 066名受试者中LDL-P水平评测CVD风险甚至优于LDL-C和非HDL-C[2,26]。因此，ATP-Ⅲ明确指出二级预防应把LDL-P<1 000 nmol/L认定为控制目标值[26]。

HTG患者常伴有胰岛素抵抗、代谢综合征和糖尿病等基础代谢异常。sd-LDL-P水平在此类患者的临床评价中有重要意义：例如胰岛素抵抗动脉粥样硬化研究(insulin resistance atherosclerosis study，IRAS)发现代谢综合征和2型糖尿病患者，LDL-P浓度，而非LDL-C水平，与胰岛素抵抗的严重程度正相关；Framingham心脏研究也得出类似结论，即糖耐受程度与LDL-P水平紧密相关，而与LDL-C则不相关。胰岛素增敏药物吡格列酮和n-3脂肪酸[鱼油中提取的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳已烯酸(DHA)]可有效降低2型糖尿病患者血浆中LDL-P浓度，从而降低心肌梗死后患者心血管疾病死亡率(总体死亡率降低20%、心血管死亡事件减少30%、猝死的发生率降低45%)[27]；贝特类降脂药物则通过激活过氧化物酶增生体活化受体a(PPARa)，调节LPL、载脂蛋白AⅠ和AⅡ的表达，使sd-LDL-P转变为大而疏松的LDL，改善血脂紊乱状态[28]。值得注意的是，此项研究的血脂检测数据均通过VAP+检测方法获得。

目前测定sd-LDL-P的主要方法包括：梯度凝胶电泳、超速离心、微流控技术法和质子核磁共振光谱(NMR)等。这些方法流程比较复杂，检测时间长，仪器十分昂贵，检测成本过高，难以在临床推广。VAP+对LDL-P可有效快速分离且保存原始状态，重复性和分辨率较好也得到部分实验室和相关生产厂商的验证和认可。其自带计算软件将LDL按体积和密度大小分为A型、B型和AB中间型，较科学地反映出患者体内LDL-P真实水平，为临床干预提供数据支持。例如当患者标本检测提示LDL-P B型或AB中间型时，通过apoB的免疫检测印证，患者外周血中的sd-LDL-P实际数量远高于正常，需要将LDL-C控制到更低水平[29]。

4 小结及展望

血脂和脂蛋白的异质性和复杂性导致LDL检测数据在HTG的影响下部分出现偏差，对心血管疾病的干预造成负面影响。因此，临床对科学、准确的LDL检测提出了更高要求。VAP+血脂检测在经典的超速离心法基础上优化技术和流程，较为真实地反映出血浆脂蛋白的分布状态和各组分胆固醇水平(VAP+检测脂蛋白亚型的应用笔者在同类文章中另作说明)，避免高TG带来的Friedwald公式法误差；同时，VAP+对LDL-P独立分析，明确颗粒型别，为临床提供新的实验室数据支持。

但需要注意的是，目前测定LDL-C和LDL-P的方法众多，流程均缺乏标准化，很大程度上造成研究结果和结论不一致，对血脂在临床疾病诊疗中的应用价值造成负面影响。许多医生认为结论不确定，则检测无必要。虽然VAP+技术在美国已经开展20余年积累了很多数据，但在中国本土仍缺乏多地区多中心标准化的对比试验，本文中就没有收集到大规模的同类型产品比对数据。因此，相关技术引入的企业和实验室更需要在VAP+血脂检测项目的标准化、规范化、溯源性和适用性等方面做出努力，明确人群的参考区间和适用程度，以益于未来流行病学研究、降脂药物试验和临床应用的开展；并主动适应医学检验实验室自动化建设的发展前景，提供更具创新和前瞻性的VAP+血脂检测模块。