人可溶性生长刺激表达基因2蛋白的真核表达、纯化和鉴定

汪慧，张天成，凌薇，陈盛霞，姜旭淦(江苏大学医学院，江苏镇江 212013)

人可溶性生长刺激表达基因2(soluble growth stimulating expression gene 2，sST2)定位于2号染色体2q11.2，sST2蛋白含有 328个氨基酸，具有3个免疫球蛋白结构域以及9个糖基化位点[1-2]，可在心脏、肺、肾和小肠等部位以及淋巴细胞、肥大细胞及多种内皮细胞中表达产生[3-4]。一些学者研究人sST2蛋白的结构、作用机制及其临床应用价值，发现人sST2蛋白的检测对于临床诊断心力衰竭、风湿免疫病以及过敏性疾病等具有重要价值[5-6]。2017年，美国心脏病学会基金会/美国心脏协会(American College of Cardiology Foundation/American Heart Association，ACCF/AHA)确定将sST2蛋白加入到慢性心力衰竭急性期和急性加重期危险分层指南中[7]。目前国内可用于临床的人sST2蛋白检测试剂盒均采用免疫学方法，且多为进口产品，价格昂贵，限制了其在临床疾病诊断与治疗中的应用与发展。因此，需要获得高纯度的人sST2蛋白抗原，为建立更多免疫学检测方法提供基础。本研究旨在构建人sST2重组真核表达载体，获得高纯度的人sST2重组蛋白，为研究人sST2蛋白检测方法提供实验依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1质粒、菌株和细胞 PGH-T质粒、大肠埃希菌DH5α均由本实验室保存；HUVEC细胞由ATCC细胞库提供；pcDNA3.1-his(-)质粒、COS7细胞由丰晖生物公司提供。

1.1.2主要试剂和仪器 ECM细胞培养液(美国ScienCell公司)；Trizol、Lipo2000(美国Thermo Fisher Scientific公司)；抗HIS标签抗体(南京诺唯赞公司)；逆转录试剂盒、Tag Mater Mix PCR预混液(日本TaKaRa公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、去内毒素质粒提取试剂盒(北京康为世纪公司)；人sST2检测ELISA试剂盒(杭州联科生物公司)；PCR仪(德国Eppendorf公司)；酶联仪、FCQ凝胶成像仪及垂直电泳仪(美国BioRad公司)。

1.2方法

1.2.1人sST2cDNA的获取 按照Aoki等[8]的方法用ECM培养基培养HUVEC细胞。用Trizol法提取细胞总RNA，采用逆转录试剂盒得到人sST2基因cDNA。

1.2.2人sST2基因的获取 根据NCBI的人sST2基因全长序列(GenBank: D12763.1)[3]，用Primer Premier 6.0软件设计得到用于扩增产物长度为1 002 bp的人sST2基因的上游引物(F)：GGCGGAT

CCTCTTGATTGATAAACAGAATG，下划线为BamH Ⅰ酶切位点，下游引物(R)：GGCAAGCTTGAAACACT

CCTTACTTGGATT，下划线为HindⅢ酶切位点。引物由上海亦欣生物公司合成。PCR反应条件为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，29个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，再用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，得到人sST2基因。

1.2.3人sST2-pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体的构建与鉴定 将人sST2与PGH-T质粒连接构成重组克隆载体，转化大肠埃希菌DH5α感受态，经过氨苄抗生素筛选，获得阳性克隆后，采用质粒提取试剂盒提取质粒并送上海生工生物公司测序。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切经测序正确的阳性质粒以及pcDNA3.1-his(-)质粒。采用T4连接酶使人sST2和pcDNA3.1-his(-)质粒连接，得到重组真核表达载体并转化大肠埃希菌DH5α感受态，氨苄抗生素筛选后，获得阳性克隆，用去内毒素质粒提取试剂盒提取人sST2-pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组真核表达载体，酶切产物琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4人sST2蛋白的表达与纯化 采用Lipo2000脂质体转染法，将重组真核表达载体转染COS7细胞，6 h后用DMEM高糖完全培养基换液，24 h后开始收集细胞培养上清液。采用镍柱亲和分析法将细胞培养上清液过柱纯化，得到纯化的人sST2蛋白。采用透析袋蔗糖浓缩法，得到浓缩的人sST2蛋白，分装入1.5 mL EP管中，-20 ℃保存。

1.2.5人sST2蛋白的鉴定 用考马斯亮蓝染色法鉴定人sST2蛋白的位置大小与纯度。用western blot法鉴定人sST2蛋白是否含有His标签。用人sST2检测ELISA试剂盒检测纯化的人sST2蛋白是否具有与抗人sST2抗体特异性结合的抗原表位。

2 结果

2.1RT-PCR法扩增人sST2基因 逆转录法得到基因组cDNA后，利用特异性PCR引物，扩增人sST2目的基因，产物经琼脂糖凝胶电泳，在约1 000 bp处出现目的条带(见图1)，与理论PCR产物大小(1 002 bp)一致。

注：M,DL 2 000 DNA marker;1～3,人sST2基因PCR扩增产物。

2.2人sST2-PGH-T重组载体鉴定 人sST2-PGH-T重组载体转化大肠埃希菌DH5α感受态后，经菌落PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳出现阳性条带。同源比对分析结果显示人sST2成功插入T载体(只出现1个碱基突变)(见图2)。

注：Query为人sST2目的基因序列，Sbjct为测序所得基因序列(1个基因突变)

图2人sST2-PGH-T载体同源性比对分析

2.3人sST2-pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体鉴定 用BamHⅠ和HindⅢ双酶切人sST2-PGH-T重组载体和pcDNA3.1-his(-)质粒后琼脂糖凝胶电泳显示产物电泳位置与预期一致(见图3)，目的片段胶回收后T4酶连接获得人sST2-pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体并再次BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果显示产物电泳位置与预期一致(见图4)。

注：DL 2 000 DNA marker; 1、2，pcDNA3.1-his(-)质粒双酶切产物；3、4，人sST2-PGH-T载体双酶切产物。

图3pcDNA3.1-his(-)质粒及人sST2-PGH-T载体双酶切产物鉴定

注：M,DL 2 000 DNA marker;1、2，重组表达载体双酶切产物。

2.4人sST2蛋白表达与纯化 将人sST2-pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体转染COS7细胞，对转染试剂的用量及转染时间进行优化，用RT-PCR法分析转染效率(见图5)。考马斯亮蓝染色法鉴定纯化人sST2蛋白的相对分子质量(Mr)约在65 000(见图6)。

注：M,DL 2 000 DNA marker;1，阴性对照(加入重组表达载体但未添加转染试剂)；2～5(转染细胞24 h后的RT-PCR)，转染试剂依次为1、1.5、2、2.5 μL Lipo2000/孔；6～9(转染细胞48 h后的RT-PCR)，转染试剂依次为1、1.5、2、2.5 μL Lipo2000/孔。

图5人sST2-pcDNA3.1-his(-)重组表达载体转染COS7细胞后RT-PCR凝胶电泳分析

注：M,蛋白质marker;1,未纯化的细胞培养上清液；2～6，纯化后的人sST2重组蛋白。

图6SDS-PAGE电泳鉴定人sST2重组蛋白纯度

2.5人sST2蛋白鉴定 western blot法显示人sST2蛋白有可与抗His标签抗体发生特异性结合的His标签(见图7)。ELISA试剂盒显示人sST2蛋白有可与抗人sST2蛋白抗体发生特异性结合的抗原表位(见图8)。

注：1，未纯化的人sST2重组蛋白；2、3；镍柱亲和层析纯化的人sST2重组蛋白。

图7western blot法鉴定人sST2重组蛋白

注：1,阳性对照；2，空白对照；3～5，人sST2重组蛋白。

图8ELISA试剂盒鉴定人sST2重组蛋白

3 讨论

人sST2蛋白与IL-33结合，抑制Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子，调节机体的免疫应答，使心肌纤维化及心肌肥厚加重，最终发生心力衰竭[9]。Yucel等[10]研究显示心力衰竭患者血清sST2蛋白水平明显升高。2014年中国心力衰竭指南推荐认为sST2蛋白等指标在急性或慢性心力衰竭的危险分层中可能提供额外信息[11]。对于SLE[12]、类风湿性关节炎[13]以及过敏性哮喘[14]等免疫调节异常所致疾病患者，血清sST2蛋白水平也较健康人对照组明显升高。这些研究结果说明了在临床开展血清人sST2蛋白检测的重要性和必要性。

本研究通过富含生长因子的内皮细胞专用营养培养基ECM培养HUVEC细胞，设计合成一对引物，成功通过RT-PCR的方法扩增得到人sST2目的基因片段。Yoshida等[15]研究发现原核表达的sST2蛋白，其免疫产生的抗sST2抗体可能因为缺乏转录及翻译后的加工机制而不适用于临床检测。本研究所用的pcDNA3.1-his(-)质粒优势考虑以下两点：(1)作为真核表达载体，其基因高效表达的同时，真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系，其表达的外源蛋白更接近天然蛋白。(2)在其氨基末端设计加有6个His标签，通过该标签与镍柱颗粒的结合来实现亲和层析法纯化目的蛋白，同时，由于His标签相对分子量小，免疫原性相对较低，一般不影响目的蛋白的功能，实验后期无需切除标签，也利于直接免疫动物制备抗体。故本实验采用真核表达系统，成功构建了人sST2-pcDNA3.1-his(-)重组真核表达载体，又利用脂质体转染法在COS7细胞中过表达产生大量人sST2蛋白。

目前临床上血清人sST2蛋白的定量检测ELISA试剂盒来源渠道较少，国内外少见关于研究制备可靠的人sST2蛋白标准品及其检测抗体甚至检测试剂盒方法的报道。本研究成功获得具有免疫学活性的人sST2重组蛋白，为后续动物免疫制备人sST2蛋白单克隆抗体及开发可靠的人sST2蛋白检测试剂盒提供了实验基础。