利用Loxp/Cre重组酶体系构建脂肪组织GGPPS特异性缺失的小鼠模型

薛晓萌, 刘 健

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

肥胖由于其发病率高成为了全世界范围内的流行性疾病[1-2],脂肪组织是一个与机体能量调控相关的内分泌器官,脂肪组织与肥胖密切相关,因此从脂肪组织的角度去考察肥胖发生的相关机制是充分合理的[3-4]。

甲羟戊酸途径是一种重要的代谢途径,它是以乙酰辅酶A为原料合成甲羟戊酸,之后甲羟戊酸可以转变成甾醇(例如胆固醇)以及类异戊二烯基团(如焦磷酸法尼酯FPP和香叶基香叶酯GGPP)[5-6]。这些类异戊二烯基团可用于一些参与细胞内信号转导的蛋白(尤其是小GTP结合蛋白)的翻译后修饰,并且对于体内的细胞生长/分化、基因的表达、蛋白的糖基化以及细胞骨架的组装十分重要[7-8]。香叶草基合成酶(Geranylgeranyl bisphosphate synthase，GGPPS)是参与甲羟戊酸途径的酶,它是产生异戊二烯化基团的关键酶。GGPPS通过消耗FPP合成GGPP,精确调控细胞内FPP和GGPP的含量,进而调控细胞内各种小G蛋白的异戊二烯化修饰从而参与到细胞进程中[9-10]。

Loxp/Cre重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用[11-12]。该系统由2个部分组成:①Loxp位点是一段长34 bp的DNA序列,它是重组酶的识别位点;② Cre重组酶是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白,可以引发Loxp位点的DNA重组。当靶基因序列位于2个Loxp位点之间时,在Cre重组酶的作用下该DNA序列就可以被敲除或发生序列倒置[13]。本文选择Loxp/Cre重组酶系统构建脂肪组织GGPPS特异性缺失的小鼠模型,为研究肥胖发生的机制提供了新的切入点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

本实验所用鼠尾DNA提取试剂盒购于南京诺维赞生物科技有限公司；2×ES Taq master mix购于康为世纪公司;Trans 2K plus DNA marker购于北京全式金生物科技有限公司;逆转录试剂盒购于Invitrogen;Trizol RNA提取试剂盒、Oligo d(T)、 dNTP、定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂SYBR Green Mixture均购于Takara公司。所用引物序列见表1所列，均购于生工生物工程有限公司。

表1 本文所用引物序列

1.1.2 实验小鼠

本实验所用到的SPF级Ggpps-floxed型和aP2-Cre小鼠,购自南京模式动物研究所。选择Ggpps-floxed的小鼠与aP2-Cre的小鼠进行杂交,然后对小鼠子代进行基因鉴定。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的DNA提取

剪取1～2 mm的鼠尾置于1.5 mL的EP管内,加入50 μL的消化液(48 μL Lysis buffer+2 μL protease)后放入70 ℃烘箱消化3～4 h。消化完成后放入100 ℃水浴锅中5 min使蛋白酶灭活,10 000g下4 ℃离心5 min,取上清即为小鼠的DNA,于-20 ℃保存。

1.2.2 小鼠的基因鉴定

以小鼠的DNA为模板,建立20 μL体系(2×ES Taq Master Mix 10 μL,GGPPS和Cre的上下游引物各0.8 μL,双蒸水7.9 μL,模板0.5 μL)进行PCR,Loxp的PCR程序如下:① 94 ℃、2 min,1个循环；② 94 ℃、30 s，61 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共30个循环；③ 72 ℃、7 min, 1个循环。Cre的PCR程序如下:① 94 ℃、2 min，1个循环；② 94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、50 s，共30个循环；③ 72 ℃、7 min, 1个循环。得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳110 V,30 min。Loxp、Cre的DNA条带分别为650、480 bp。

1.2.3 组织RNA提取以及定量PCR

称取100 mg小鼠的白色脂肪组织,20 mg棕色脂肪组织以及其他组织(如脑、肝脏、肾脏、肌肉等),按Trizol RNA提取试剂盒提供的方法提取总RNA。利用Invitrogen 逆转录试剂盒得到cDNA并于-20 ℃保存。

1.2.4 组织蛋白提取以及Western blot

100 mg小鼠脂肪组织加入500 μL的RIPA裂解液于冰上研磨充分后于摇床上放置30～60 min, 1 000g下4 ℃离心30 min,取上清即为组织蛋白。利用BSA浓度测定的方法测定组织蛋白的浓度,之后进行Western blot。

1.2.5 统计学处理

实验结果用SPSS统计学软件进行方差分析,所有数据以(均数±标准差)表示,双侧P<0.05为统计学意义上的显著性差异。

2 结 果

2.1 Loxp/Cre重组酶系统

Loxp/Cre重组酶系统是目前常用的条件性基因打靶技术,当目的基因的DNA序列位于2个Loxp位点之间时,Cre重组酶就会识别该位点并将2个Loxp位点之间的DNA序列敲除。而脂肪组织中特异表达的启动子为aP2,利用带有aP2启动子的Cre小鼠就可以获得脂肪组织基因缺失的小鼠模型,如图1所示,当目的基因位于2个Loxp位点之间时,Cre重组酶就可以识别这2个Loxp位点,从而将这2个位点间的靶基因敲除。

图1 Loxp/Cre重组酶系统敲除靶基因GGPPS

2.2 GGPPS特异性缺失小鼠模型的构建

本文利用鼠尾DNA提取试剂盒提取了小鼠的DNA,并利用PCR进行DNA片段的扩增,进行琼脂糖凝胶电泳,如图2a所示。

在650 bp处有Loxp单条带,则代表小鼠的基因组中同时插入的2个Loxp位点基因,如图2b所示。

图2 脂肪组织GGPPS特异性缺失小鼠的基因鉴定

若在450 bp处有Cre基因的条带,则代表小鼠的基因组中插入了Cre基因。若小鼠的基因组中同时具有2个Loxp位点基因以及Cre基因,则为脂肪组织GGPPS特异性缺失的小鼠Ad Ggpps KO,即GGPPS-/-型。

2.3 小鼠模型构建的验证

2.3.1 mRNA水平的验证

为了初步探究所建小鼠模型是否建立成功,分别提取正常小鼠GGPPS+/+型和基因缺失的GGPPS-/-型小鼠的3种脂肪组织以及肝脏、肌肉、肾脏、大脑、肺等组织的RNA,之后利用定量PCR的技术对小鼠组织中GGPPS的mRNA水平进行检测,结果如图3所示。图3中，SAT为皮下脂肪组织；EAT为附睾脂肪组织；BAT为棕色脂肪组织。从图3可以看出,与GGPPS+/+型的小鼠相比,GGPPS-/-型小鼠的脂肪组织中,GGPPS的mRNA水平明显降低,而其他组织(例如肝脏、肌肉、肾脏、大脑等)中GGPPS的mRNA表达量无变化。

图3 脂肪组织和非脂肪组织中GGPPS的mRNA表达情况

2.3.2 蛋白水平的验证

分别提取GGPPS+/+型和GGPPS-/-型小鼠的脂肪组织以及非脂肪组织的蛋白,利用Western blot去检测小鼠组织中GGPPS的蛋白表达水平,如图4、图5所示。从图4、图5可以看出,与GGPPS+/+型小鼠相比,在GGPPS-/-型小鼠的非脂肪组织中,GGPPS的蛋白表达水平没有变化,而脂肪组织中GGPPS的蛋白表达水平显著降低。由此证明脂肪组织GGPPS特异性缺失的小鼠模型建立成功。

图4非脂肪组织中GGPPS的蛋白表达水平以及定量的结果

图5 脂肪组织中GGPPS的蛋白表达水平以及定量的结果

3 讨 论

脂肪组织分泌的脂肪因子(例如脂联素、瘦素、白介素16等)参与机体中许多重要的细胞代谢进程,与肥胖以及相关代谢疾病的发生密切相关。这些脂肪因子作为大分子物质,其在体内的分泌和运输需要借助于机体中的囊泡运输体系。在大分子物质的囊泡运输过程中,小G蛋白的翻译后异戊二烯化修饰与之密切相关。在甲羟戊酸途径中,GGPPS作为调控活化的异戊二烯化基团产生的关键酶,与异戊二烯化基团的产生密切相关,并由此影响到参与囊泡运输的小G蛋白的翻译后修饰。因此在脂肪组织中,GGPPS与脂肪因子的分泌可能存在一定的联系,从而影响到与脂肪因子相关的代谢进程。

Cre重组酶稳定的性质使Loxp/Cre重组酶系统具有快速高效的特点。利用Loxp/Cre重组酶系统构建脂肪组织GGPPS特异性缺失的小鼠模型,为之后研究GGPPS与脂肪因子囊泡运输以及与脂肪因子相关的代谢疾病的发生机制奠定了基础。