结核分枝杆菌RNA解旋酶RhlE的蛋白表达、纯化及结构性质研究

刘雪鹤，李正阳，高文青，洪利国，甘建华，李继喜

(1.复旦大学 生命科学学院，上海 200438； 2.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)

结核分枝杆菌引起的结核病是危害严重、传染性较强的全球慢性传染病之一，具有潜伏感染的特性.由于结核分枝杆菌细胞壁含有大量的分枝菌酸，对干燥、理化等因素抵抗能力强，可在环境中长时间保持活性与毒力，比如在阴暗灰尘中可存活90～120d、痰中可存活6～8个月[1].

RNA解旋酶(RNA helicases)是一个包含了与RNA代谢(从翻译起始、核糖体形成、前mRNA拼接和mRNA降解)许多方面有关的蛋白质家族.RNA解旋酶依赖于ATP水解，识别并依赖于单链结构的存在，在RNA复制过程中起到催化双链RNA解旋的作用[2-3].

在已知的核糖体组装因子中，DEAD-box解旋酶家族蛋白起着关键作用.DEAD-box解旋酶有9个特征性基序，以其中MotifⅡ的氨基酸序列d-e-a-d而命名.这些蛋白具有RNA解旋酶活性，可解旋游离的双链RNA；同时在多个生理过程中起着重要作用，比如可作为RNA分子伴侣，介导RNA-蛋白重组[4-5].结核分枝杆菌内切核糖核酸酶E(RhlE)依赖于ATP水解，属于RNA降解体中的RNA解旋酶[6-10].RNA降解体(RNA degradosome)在RNA代谢和核糖体组装中起着重要作用.尽管结核分枝杆菌RNA降解体研究较少，但对大肠杆菌来源的RNA降解体的研究，表明其可根据环境的变化来选择并招募解旋酶和其他辅助蛋白来装配自己，主要包含5个同源蛋白： CSDA，DBPA，RhlB，RhlE和SRMB.这些酶具有特定的功能： SrmB和CSDA参与核糖体的生物合成[11-13]，RhlB参与mRNA的降解[14-15]，DbpA参与了mRNA降解，其解旋酶活性依赖于23S rRNA[16-18]，而RhlE调控其他解旋酶，一旦缺失可引起核糖体成熟延滞[19-20].结核分枝杆菌RNA降解体在宿主巨噬细胞发挥侵染过程中起着重要作用.因此，针对RNA降解体尤其是关键调控蛋白RhlE的研究可为发掘新型抗结核感染药物提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料和主要试剂

1.1.1 材料

各种限制性内切酶、以及T4DNA连接酶等均购自TaKaRa公司.E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)plys S感受态菌株，大肠杆菌表达载体pMST3质粒均是本实验室保存，镍柱亲和层析柱和凝胶过滤层析柱均购自GE Healthcare.DNA序列测定由上海擎科公司完成.

1.1.2 主要试剂

β-ME(β-巯基乙醇)购自Amresco公司，蛋白Maker购自NEB公司与Thermo-fisher公司，蛋白浓缩管(30kDa/50kDa)购自Millipore公司，带有发光基团Cy3/Cy5的单链RNA购自金唯智公司.

1.2 方法

1.2.1 结核分枝杆菌RhlE的克隆，蛋白表达及纯化

以结核分枝杆菌MycobacteriumtuberculosisH37Ra(无毒株)基因组DNA片段作为模板扩增获得了全长RhlE蛋白(NP_217727.1).选用BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点将该目的基因连接到N端可表达6× His-Sumo标签的pSMT3载体中.经测序正确后将重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)plysS细胞中用于蛋白表达.当OD600达到0.8时，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG在16℃条件下诱导蛋白表达.20h后于4℃以6000r/min离心20min收集细菌，将细菌沉淀重悬于裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，500mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，5%甘油，2mmol/L β-ME)中经高压破菌仪破碎，然后在4℃以18000r/min离心60min去除细胞碎片.将收集到的上清溶液通过镍亲和层析柱(GE Healthcare)纯化并在缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，5%甘油，2mmol/L β-ME)中洗脱.经Ulp1酶酶切后，透析去除His-Sumo标签，再用Superdex 200 16/600凝胶过滤层析柱(GE Healthcare)进一步纯化RhlE蛋白，其洗脱缓冲液为20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，300mmol/L NaCl，2mmol/L DTT.蛋白纯化鉴定参考文献[21]，使用SDS-PAGE方法.

1.2.2 动态光散射(DLS)分析

动态光散射(DLS)测定参考文献[22]，在DynaProNanoStar(Wyatt Technology， USA)的DYNAMICS软件上完成，光源波长为658nm，固定散射角为90°.将结核分枝杆菌RhlE稀释至1mg/mL，稀释缓冲液成分为20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，300mmol/L NaCl，2mmol/L DTT，每个样品测量10次.

1.2.3 RhlE酶活性质的测定

酶活性质测定所用的RNA底物均购自金唯智公司，序列如下： Cy5标记的RNA单链，Cy5-5′-GCUUUACGGUG-3′；Cy3标记的RNA单链，5′-AACAAAACAAAAUAGCACCGUAAAGC-3′-Cy3；未标记的RNA单链，5′-UAGCACCGUAAAGC-3′.RNA粉末溶于DEPC水，Cy5标记的RNA单链与Cy3标记的RNA单链共20μmol/L，在75mmol/L KCl和10mmol/L Hepes-Na(pH 7.5)缓冲液中室温孵育10min，构成复合物底物(图1).此复合物在解旋酶RhlE的解旋作用下打开双链，Cy3荧光强度增强，由Cy3至Cy5的荧光偏振强度减弱.

RhlE解旋缓冲液为： 10mmol/L Hepes-Na(pH 7.5)，60mmol/L NaCl，55mmol/L KCl，5%(体积比)甘油.反应体系包括20nmol/L双荧光基团复合物，0.2μmol/L未标记的RNA单链，和2mmol/L ATP/Mg，最后加入RhlE蛋白(0.6μmol/L).底物荧光基团(Cy3)在500nm波长处激发，565nm波长处发射.与此同时，Cy3到Cy5两荧光基团的荧光共振能量转移由540nm波长处激发，由665nm波长处发射.参考文献[23]，通过M5e酶标仪(美谷分子仪器上海有限公司SpectraMax M5)进行检测，所有实验均有3组平行.

1.2.4 小角散射分析RhlE蛋白

小角X射线散射(SAXS)是指当X射线透过试样时，在靠近原光束2°～5°的小角度范围内发生的散射现象.被用于分析蛋白轮廓，测定蛋白在溶液中的大小、形状及分布.对于完全均匀的物质，其散射强度为零.当出现第二相或不均匀区时才会发生散射，且散射角度随着散射体尺寸的增大而减小.新鲜纯化好的RhlE蛋白在国家蛋白质中心上海光源BL19U2线站上收集数据.蛋白浓度为1～5mg/mL，缓冲液为20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，100mmol/L NaCl.每个蛋白样品重复3次，并以空白缓冲液做对照.收集的SAXS数据，经PRIMUS和GASBOR软件处理，得出RhlE蛋白分子轮廓.分析工作均在上海光源BL19U2线站进行，其波长为1.03Å.具体流程参考文献[24]，所用程序均来自ATSAS程序包(https：∥www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html).

2 结果与分析

2.1 RhlE与同源家族解旋酶蛋白的生物信息学分析

为了揭示蛋白RhlE的潜在催化活性位点，将RhlE和DEAD-box家族的其他同源酶类(包括嗜热脂肪芽孢杆菌来源的CshA，幽门螺旋杆菌来源的RhpA，蜡样芽胞杆菌来源的CshE，豌豆蚜来源的DeaD)进行了多序列同源比对，结果见图2.二级结构比对是基于CshA的晶体结构通过Clustal W(https：∥www.genome.jp/tools-bin/clustalw)进行的，然后用ESPript3.0(http：∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)进行显示.结果表明RhlE与其他几个酶均具有较多共有的区域，这表明RhlE确实属于DEAD-box家族.

2.2 RhlE蛋白的表达和纯化

重组RhlE质粒在大肠杆菌中可溶性表达且表达量较高.通过镍柱亲和层析纯化后获得高纯度的重组蛋白，使用凝胶过滤层析柱Superdex 200 16/600进一步纯化，Ulp1酶酶切去除Sumo标签后的RhlE蛋白，在凝胶过滤层析柱上以98ml的峰洗脱出来，其对应分子量为60kDa，与理论分子量52.8kDa相符合，表明RhlE在溶液中以单体形式存在，如图3(a)所示，其洗脱样品的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析结果如图3(b)所示.

2.3 动态光散射(DLS)分析RhlE蛋白溶液均一性

动态散射光(DLS)用于确定蛋白溶液中颗粒的粒度分布，以评估蛋白溶液的均一性.通常Pd%(Polydispersity%)<20%的样品被认为是单分散溶液.通过DLS测定表明RhlE蛋白在溶液中拥有两个峰，如图(4)所示，峰1的半径、Pd%和Mass%分别为8.2nm、8.7%和92.0%.峰2的半径、Pd%和Mass%分别为108.2nm、24.9%和8.0%.综上所述，RhlE蛋白在溶液中是均匀分布的.

2.4 RhlE的酶学活性分析

为了揭示RhlE蛋白的催化活性和酶学特性，我们对其酶学性质进行了测定.酶活反应是在22℃，10mmol/L Hepes(pH 7.5)，60mmol/L NaCl，55mmol/L KCl，5%甘油(体积比)的反应液中进行，通过RhlE水解带有荧光发光基团的双链RNA底物的能力来确定[23]，此底物在解旋酶RhlE的解旋作用下打开双链，通过由Cy3至Cy5的荧光偏振强度和对Cy3荧光强度的测定来检测RhlE蛋白的解旋酶能力.当由Cy3至Cy5的荧光偏振强度减弱，说明拥有完整结合形态的RNA底物浓度降低，RhlE存在有效的解旋能力，当Cy3荧光强度增强，说明解旋开来的带有Cy3标记的RNA单链浓度升高，同时也证明了RhlE的解旋能力.测定结果如图5所示.可以看出，当有ATP/Mg存在情况下，RhlE可以解旋带有荧光基团的双链RNA底物，具有较高活性(双链RNA的荧光强度设定为1)；同时在ATP/Mg的存在下荧光偏振相对强度较低.二者结合表明，在ATP/Mg存在时，大肠杆菌表达纯化的RhlE可以高效解旋双链RNA底物.

2.5 RhlE小角散射(SAXS)分析

我们主要通过SAXS来研究RhlE在溶液中的结构轮廓.收集到的SAXS数据经相应软件(primus与pymol软件)处理后，发现RhlE蛋白在溶液中形成骨头形状，如图6所示.通过GNOM计算出分子距离分布函数(Interparticle Distance Distribution Function)P(r)，可以得到RhlE在溶液中粒径大小为125Å.后使用Dammin软件进行3D建模，并将模型与同源性为43.39%的ATP依赖性解旋酶CshA(PDB： 5IVL)三维结构模型相叠加，结果如图6(c，d)所示，CshA结构与RhlE分子轮廓基本吻合，这表明解旋酶RhlE与CshA具有结构上的保守性，其参与的生理功能也很相似[25].

3 讨 论

结核病是由结核分枝杆菌引起的全球范围的慢性传染病，危害严重.我国是结核病高发病国家之一，发病人数仅次于印度位居世界第二位[26].已有研究表明，大肠杆菌来源的RhlE广泛存在于不同细菌中，尤其在嗜冷生物适应性中起着重要的功能.RhlE参与RNA降解体的形成，通过解旋双链RNA的螺旋结构来辅助PNP酶的活性，对核糖体的装配有着重要的意义[27].同时，结核分枝杆菌来源的RhlE与大肠杆菌RhlE的一级序列同源度为51%，所参与的生理功能类似.我们克隆、表达并纯化了结核分枝杆菌RhlE，并结合DLS和SAXS进行了分析，发现RhlE具有解旋双链RNA的活性，在溶液中性质均一，以单体形式存在，这些发现可以为将来进一步通过结构生物学手段解析其三维结构，阐述其功能提供重要的参考价值.另外，结核病治疗药物盐酸莫西沙星氯化钠，通过抑制细菌解开DNA超螺旋的解旋酶拓扑异构酶Ⅱ的酶活性而起作用.因此，RhlE作为结核分枝杆菌来源的RNA解旋酶，也有可能作为结核病的药物靶点，对以后结核病的药物靶点研究起到借鉴作用.