拟南芥中MRG2与BAF60相互作用的研究

蔡茜茜，苏 伟

(1.复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所，上海 200438； 2.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)

MRG2是拟南芥中MRG家族成员之一，与酵母的Eaf3(ESA1-associated factor 3)，果蝇的MSL3(Male-Specific Lethal 3)以及哺乳动物的MRG15(Morf-Related Genes on chromosomes 15)同源.MRG家族蛋白都含有两个保守的结构域，分别是处于N端的Chromo结构域和C端的MRG结构域[1-3].酵母中Eaf3是组蛋白乙酰化转移酶NuA4复合物的组成成分，同时也是组蛋白去乙酰化酶Rpd3S复合物的组成成分.研究发现，Eaf3的Chromo结构域与H3K36甲基化相互作用，促进Rpd3S在基因编码区的去乙酰化作用[4-5].果蝇MSL蛋白对于提高雄性X染色体的转录至关重要，MSL复合物通过扩散组蛋白H4K16乙酰基标记来上调相关基因的转录[6-7]，也有研究表明： MSL3是三甲基化修饰的H3K36的阅读蛋白，MSL3中的Chromo结构域还可以在体外结合DNA和甲基化状态的H4K20[8-9].哺乳动物中MRG15缺失导致小鼠胚胎死亡、纤维细胞坏死、细胞加速衰老和DNA修复功能损失等表型，表明MRG蛋白在许多细胞活动中发挥重要的调控作用[10-11].MRG结构域能够结合多种转录调节因子和染色质重塑因子，包括组蛋白去乙酰化酶转运共阻遏物mSin3A和核蛋白PAM14(Protein-Associated MRG， 14kDa)[12].人类MRG15可以调节核小体组蛋白H4和H2A的乙酰化修饰水平，这种修饰可以改变核小体与DNA之间的相互作用，从而促进修饰后的组蛋白与其他调节转录激活蛋白之间的相互作用.另外，MRG15通过阅读三甲基化修饰的H3K36参与基因的转录调控、RNA前体可变剪切和染色质重塑[13-15].

MRG蛋白家族在高等植物中的研究相对较少.我们实验室的前期研究表明： 水稻MRG702(Morf-Related Gene 702)作为H3K36的甲基化阅读蛋白，识别H3K36甲基化修饰，基因表达下调的MRG702Ri植株呈现晚花、剑叶叶夹角变小、节间变短、分蘖减少等表型，参与油菜素甾醇信号通路调控[16].我们实验室和Toshiro Ito实验室分别发现并报道了拟南芥MRG1/2作为组蛋白甲基化阅读蛋白，能够识别H3K36甲基化并招募转录因子CO(transcription factor CONSTANS)，促进FT(FLOWERINGLOCUST)基因的表达，进而促进植物开花[17-18].此外，MRG还能够与PIF7(Phytochrome-Interacting Factor 7)相互作用，参与拟南芥避荫反应调节[19].

SWI/SNF(Switching/Sucrose Non-Fermenting)复合物是ATP依赖的染色质重塑蛋白，依赖ATP水解能量改变核小体结构，同时能够识别组蛋白末端的乙酰化，通过结合肌动蛋白或其相关蛋白ARPs(nuclear Actin-Related Proteins)调节复合物与染色质的结合[20-22].酵母中SWI/SNF同源复合物能够和乙酰转移酶共同参与激活目的基因的转录表达[23-25].除了调节基因转录功能以外，酵母ySWI/SNF(yeast SWI/SNF)还参与DNA复制，促进DNA复制起始，也可以参与核小体核苷酸切除修复过程[26-27].酵母SWP73是SWI/SNF复合物的重要组分，在转录激活中发挥作用.SWP73的同系物，在果蝇中称为BAP60(Brahma Associate Protein 60)，在人类中称为BAF60(BRM/BRG1 Associated Factor 60).哺乳动物中BAF由9～12个亚基组成，BAF60家族最少有3个成员，包括普遍存在的BAF60a，在肌肉和胰腺组织中表达的BAF60b和BAF60c[28].

植物SWI/SNF核心酶对植物的生长发育起着至关重要的作用，核心酶的缺失会导致植株矮小，生长缓慢等多种表型[29-30].拟南芥基因组编码两个高度同源的SWP73蛋白，包括SWP73a/CHC2和SWP73b/CHC1，其中CHC1也被称作BAF60.SWP73在拟南芥叶片和花的发育中起到不同的作用，CHC2突变体表现出短日照早花表型，ChIP-seq数据显示FLC(FLOWERINGLOCUSC)表达量减少.BAF60突变体植株生长弱小，叶片和花均有缺陷，表现出晚花以及花粉不育表型[31-33].研究表明： BAF60主要通过影响组蛋白修饰和调节基因环的形成两种方式调节拟南芥基因表达.BAF60通过调节DNA可亲和性，调节下胚轴细胞大小，抑制下胚轴的伸长[34];通过抑制H3K9乙酰化，促进H3K27三甲基化，抑制细胞分裂素两个关键的合成基因IPT3(ISOPENTENYLTRANSFERASE3)和IPT7(ISOPENTENYLTRANSFERASE7)的表达，使得BAF60缺失突变体呈现根长变短，内源细胞分裂素增多的表型[35].以上报道证明，BAF60对拟南芥根系、叶片生长以及开花等多发面发展至关重要.

在真核生物中MRG和BAF60同属于表观调控因子，两者无论在哺乳动物或者拟南芥中都有着高度重合的调节功能，包括调节基因转录表达、DNA修复等.

我们的研究首先通过免疫共沉淀结合质谱分析获得了MRG2结合蛋白，并对其中的BAF60与MRG2的关系进行深入研究.体内外蛋白质相互作用实验均证实MRG2和BAF60能够相互作用.通过分析RNA-seq和RT-qPCR数据获悉在mrg1mrg2双突变拟南芥植株中多个IPT基因转录水平升高，这与之前对于BAF60突变体材料的研究结果一致.ChIP实验结果证明MRG2蛋白富集于IPT3基因编码区.这些结果证明了在植物细胞中MRG2和BAF60蛋白相互作用共同调控IPT3基因的转录表达，有助于理解组蛋白修饰识别蛋白在染色质结构重塑和基因表达调控方面的生物学功能.

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥(Arabidopisisthaliana)均为哥伦比亚生态型(Columbia， Col-0);大肠杆菌克隆菌株EscherichiacoliTOP10，大肠杆菌表达菌株E.coliRosetta DE3;农杆菌转化菌株AgrobacteriumtumefaciensGV3101;原核和植物瞬时表达载体为pGEX-4T-1、pET-30a、pXY103、pXY104、pXY105、pXY106;以上材料均为本实验室保存.

植物培养土壤成分： 蛭石，珍珠岩，黑土2∶1∶2比例混合;营养液： 固体花无缺1∶1000溶解在水中;MS培养基： MS-0255 4.9g/L，蔗糖10g/L，氢氧化钾调pH值5.7，固体培养基中加入9g/L琼脂粉，118℃灭菌30min;植物培养条件： 相对湿度80%，恒温22℃，光照强度100μmol/(m2·s)即适当日照条件;大肠杆菌LB培养基： 氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氢氧化钾调pH值7.0，固体培养基中加入14g琼脂粉，118℃灭菌30min，选择培养基含100μg/mL氨苄霉素或50μg/mL卡那霉素;农杆菌YEB培养基： 蔗糖5g/L，酵母提取物1g/L，牛肉提取物5g/L，蛋白胨5g/L，硫酸镁2mol/L，氢氧化钾调pH值7.2，118℃灭菌30min，选择培养基含25μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素，选择培养基成分灭菌后添加.大肠杆菌培养条件37℃，农杆菌培养条件28℃，避光.

MS-0255购自Duchefa Biochemie公司;高保真KOD酶购自Toyobo公司;质粒提取试剂、胶回收试剂购自Axygen公司;RNA提取试剂TRIzol购自Ambion公司;反转录试剂盒购自Promega公司;SYBR，DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶，rTaq酶等购自TaKaRa公司;其他常规试剂购自国药集团试剂有限公司.PCR引物合成由上海华津生物科技有限公司完成;克隆测序由上海杰李生物科技有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和荧光定量PCR

酒精消毒拟南芥种子，铺在灭菌后MS培养基上，4℃春化2d后，于培养箱中培养，14d后，使用TRIzol试剂抽提Col-0和mrg1mrg2中的总RNA，反转录按照Promega试剂盒中方法进行.荧光定量PCR使用SYBR试剂，采用PCR仪(BIO-RAD，CFX96)检测两种植物材料中基因mRNA水平，分析基因转录本，引物序列如表1所示，ACTIN2用于作为基因表达内参.

表1 定量PCR及载体构建引物列表Tab.1 Primers for Real-time PCR and Vector contruction

1.2.2 蛋白体外结合实验(Pull-down)

使用引物MRG2-1/MRG2-10扩增MRG2cDNA，并克隆到表达载体pET-30a中，转化至E.coliRosetta DE3感受态中，使用引物BAF60-1/BAF60-6，BAF60-1/BAF60-2，BAF60-3/BAF60-4，BAF60-5/BAF60-6分别扩增BAF60cDNA，并克隆到表达载体pGEX4T-1中，转化至E.coliRosetta DE3感受态中.扩大培养后收集菌体，用裂解缓冲液(1×PBS，0.1% Triton X-100，10%甘油，1mmol/L DTT，1mmol/L 蛋白酶抑制剂，100μg/mL溶菌酶)重悬，超声裂解后高速离心取上清，加入清洗后的GST珠子4℃孵育2h，使用清洗缓冲液(1×PBS，10%甘油，1mmol/L DTT，1mmol/L蛋白酶抑制剂)清洗珠子4次，使用SDS-PAGE蛋白胶检测蛋白纯化结果.HIS标签蛋白纯化与上述GST标签一致，缓冲液成分略有不同.将纯化好的GST标签蛋白用Pull-down结合缓冲液(1×PBS，0.2% NP-40，10mg/mL牛白蛋白)孵育1h，加入洗脱不带珠子的MRG2蛋白孵育3h，使用清洗缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300mmol/L氯化钠，0.5% NP-40)清洗珠子4次，利用商品化的抗体HIS(Abcam)进行Western Blot实验检验结果，引物序列如表1所示.

1.2.3 双分子荧光互补实验(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)

双分子荧光互补实验按照Sun等[36]方法进行，使用MRG-11/MRG2-12引物扩增MRG2cDNA，并克隆到载体pXY106中.使用引物BAF60-7/BAF60-8扩增BAF60cDNA，并克隆到载体pXY104和pXY105中.将上述克隆载体转化至AgrobacteriumtumefaciensGV3101中，YEB培养菌液浓度OD值到达1.0后，使用BiFC垂悬液(1mmol/L MES，10mmol/L氯化镁，100μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.6)重悬农杆菌，1∶1注射渗透到4～6周龄烟草(Nicotianabenthamiana)叶片中，使用激光扫描共聚焦显微镜(LSM 710，ZEISS德国)观察渗透后2～3d的荧光定位，引物序列如表1所示.

1.2.4 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation， ChIP)

使用酒精消毒拟南芥种子，铺在灭菌后MS培养基上，4℃春化2d，于培养箱中培养14d，浸泡于固定液中(0.4mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA，0.1mmol/L蛋白酶抑制剂，1%甲醛)，室温条件下使用真空抽抽气机抽15min，抽气3次后加入2.5mol/L的甘氨酸终止反应.Millin-Q冲洗干净之后，用纸吸干水分.用液氮冷冻将植物材料研磨为粉末，加入15～30mL ChIP裂解缓冲液Ⅰ(0.4mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L氯化镁，5mmol/L巯基乙醇，0.1mmol/L 蛋白酶抑制剂，1片Cocktail)，震荡混匀，4℃旋转孵育30min，用100μm的尼龙膜进行过滤，4℃离心20min，去上清，用裂解缓冲液Ⅱ(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L氯化镁，1% TritonX-100，5mmol/L巯基乙醇，0.1mmol/L蛋白酶抑制剂)重悬，4℃离心10min，去上清，加入300μL超声缓冲液(1% SDS，50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10mmol/L EDTA)重悬，超声处理90s，4℃高速离心10min，取上清，稀释SDS浓度为0.1%，加入抗体，4℃孵育过夜，加入40μL Protein A beads，4℃孵育1h，先后用低盐洗脱液(150mmol/L氯化钠，1% TritonX-100，20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1% SDS，2mmol/L EDTA)，高盐洗脱液(500mmol/L氯化钠，1% TritonX-100，20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1% SDS，2mmol/L EDTA)，氯化锂洗脱液(0.25mol/L氯化锂，1%脱氧胆酸钠溶液，1% NP-40，10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA)洗脱一次，TE洗脱液(10mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA)洗两次.加入500μL洗脱液(1% SDS，0.1mol/L碳酸氢钠)，65℃水浴洗脱，收集洗脱液，加入20μL 5mol/L氯化钠，65℃水浴过夜解交联.加入8μL 0.5mol/L EDTA，16μL Tris-HCl pH 8.0，2μL蛋白酶K，45℃消化1h.加入酚氯仿，离心后取上清，加入4μL DNAmate，1/10体积的3mol/L乙酸钠，加入两倍体积预冷无水乙醇，4℃高速离心20min，加入75%乙醇洗涤沉淀，荧光定量PCR方法如上所述进行.

2 结 果

2.1 MRG2相互作用蛋白的筛选

MRG是我们实验室首先报道出的，它是拟南芥MRG蛋白家族的两个成员，可以识别组蛋白H3K4和H3K36上的甲基化修饰.为了更加深入地研究MRG2在细胞核内的功能，我们通过质谱分析法获得了一些与MRG2相互作用的蛋白序列.其中包括MRG2家族蛋白，组蛋白H2A，核转运因子NTF2家族蛋白等(表2).与BAF60相关的两条特殊结合肽段质谱图见图1，它们的蛋白序列分别为DLNNLLANAEK和ILEDGVDPDQPGFVQK.比对结果显示，肽段LEDGVDPDQPGFVQK在BAF60氨基酸序列235～250位上，肽段DLNNLLANAEK在BAF60氨基酸序列427～437位上.BAF60是SWI/SNF蛋白家族之一，是一种染色质重塑复合体的重要组分，而关于拟南芥MRG家族与SWI/SNF染色质重塑复合体的关系还没有任何报道，因此我们将对拟南芥BAF60与MRG2的相互作用关系和功能进行深入研究.

表2 质谱获得MRG2结合蛋白BAF60Tab.2 Identification of BAF60 as MRG2-interacting protein by mass spectrometry experiment

2.2 体外Pull-down实验证明MRG2与BAF60能够相互作用

为了证明MRG2与BAF60在植物体内外均有相互作用，我们首先构建了BAF60全长和截短蛋白，BAF60蛋白属于SWIB蛋白家族，该家族蛋白都有一个结构和功能相似的结构域，因此我们同时构建了3个截短蛋白，分别为BAF60-1(1～314aa)、BAF60-2(315～394aa)和BAF60-3(395～534aa)，其中BAF60-2包含SWIB家族结构域(图2(a)).

将BAF60编码序列克隆到pGEX4T-1原核表达载体上，在E.coliRosetta DE3菌株中进行诱导表达，使用GST融合珠子纯化蛋白.获得体外纯和蛋白后，进行体外Pull-down实验，其中HIS-MRG2蛋白与GST蛋白作为阴性对照组.实验结果显示MRG2与BAF60在体外有较好的相互作用(图2(b))，我们发现BAF60全长可以与MRG2结合，截短蛋白BAF60-1可以与MRG2结合，证明MRG2结合于BAF60蛋白的N端，并且，质谱结果显示的特殊结合肽段LEDGVDPDQPGFVQK位于BAF60-1段蛋白序列中，这进一步证明了MRG2可以与BAF60结合.

2.3 双分子荧光互补实验证明MRG2与BAF60在植物细胞内相互作用

为了进一步证明MRG2和BAF60能够在植物体内相互作用，我们构建了pXY104-BAF60和pXY105-BAF60原核表达重组载体，将构建好的载体以及空载体分别转入AgrobacteriumtumefaciensGV3101中，YEB培养扩增，使用垂悬液重悬，并和同样方法培养的pXY106-MRG2原核表达重组载体，YEB培养扩增.将两种配对重悬液混合注射至烟草叶片中，避光培养3d.其中pXY106-MRG2/pXY104、pXY104-BAF60/pXY103和pXY106-BAF60/pXY105为阴性对照组，取烟草叶片制作玻片，使用共聚焦荧光显微镜观察叶片细胞，我们发现在烟草叶片细胞核内MRG2和BAF60有较好的蛋白结合，并且负对照组没有荧光显示(图3).

2.4 mrg1mrg2突变体中IPT表达量上升

在上一阶段中，我们已经证明了MRG2和BAF60在植物体内外均有较强的结合.Jégu等研究者的报道显示，BAF60突变体材料中IPT系列基因的表达量上升，表明BAF60能够抑制IPT基因的转录表达[35].为了探寻MRG2与BAF60是否共同作用于IPT系列基因，我们对实验室已有的RNA-seq数据进行了分析，结果显示IPT3、IPT5和IPT73种基因绝对表达量均有上升，其中IPT3和IPT7上升倍数较高(图4(a)).

我们进一步提取了mrg1mrg2突变体植株幼苗总RNA，使用RT-qPCR方法检测双突变mrg1mrg2中IPT3、IPT5和IPT7的相对表达量，发现IPT3、IPT5和IPT73种基因的相对表达量均有上升，而IPT3和IPT7相对表达量显著上升，这与RNA-seq数据变化一致，(图4(b)).检测还发现双突变mrg1mrg2中BAF60基因的表达量几乎不变(图4(c))，表明MRG1/2的功能缺失不影响BAF60基因的转录表达，猜测MRG2和BAF60在植物体内可能通过蛋白相互作用共同影响IPT基因的表达.

2.5 ChIP分析MRG2结合于IPT基因组区域

为了证实MRG2确实参与了IPT3、IPT5和IPT7基因的转录调控，我们对野生型和35S：MRG2-FLAG/Col-0过表达于野生型背景的拟南芥材料进行染色体免疫共沉淀实验(ChIP).提取14d拟南芥幼苗的核蛋白，超声破碎，把染色质的DNA消化成片段，使用FLAG抗体沉淀MRG2-FLAG融合蛋白，提取MRG2-FLAG结合的DNA，在目的基因IPT3的5′UTR区、基因内和3′UTR共选取10个区段，使用q-PCR技术检测各段DNA的含量.ChIP-PCR结果显示(图5)，在Col-0背景下，MRG2富集程度没有明显变化，而在过表达植物材料35S：MRG2-FLAG/Col-0背景下，MRG2在第4、第5、第8区段有明显富集.该区段在IPT3基因内部区，与BAF60调节H3K4me3区域一致，推测MRG2很可能与BAF60共同调节IPT3基因转录表达[35].

3 讨 论

表观遗传学调控是指在不改变DNA序列的情况下调节染色质的结构和状态，调控基因的表达，主要包括组蛋白修饰，染色质重塑，DNA甲基化，组蛋白变体等[37].MRG家族蛋白和BAF60复合物蛋白均属于表观调控因子.人类MRG15可以结合或者识别甲基化的H3K4，H3K36，通过招募转录因子或者直接参与调控目的基因转录[13-15，38].在组蛋白乙酰化方面，MRG15是组蛋白乙酰化转移酶NuA4复合物的成分之一，主要通过与乙酰化酶和乙酰转移酶相互作用，调节转录[12，39].BAF60属于SWI/SNF蛋白家族，该家族可以识别组蛋白乙酰化，将染色质重塑机制和组蛋白修饰联系在一起，协同发挥转录调控作用[22].在人类中，MRG15与hBRM都具有抑制基因转录的功能[14，40]，也都具有DNA修复的功能[38，41]，可以说两个蛋白在基因的转录调控方面都发挥了至关重要的功能.

在高等植物中，MRG2能够参与拟南芥开花通路的调控，MRG2识别FT启动子区域H3K36me3招募转录因子CO，促进FT基因转录表达，MRG2的缺失导致拟南芥晚花表型[17-18].十分巧合的是，BAF60突变体材料也表现为晚花，研究认为BAF60通过调节组蛋白标记修饰，包括促进H3K27甲基化，抑制H3K9乙酰化，以及直接调节H2A.Z沉积，染色质凝结成环抑制FLC的表达[42-43].BAF60还能调节拟南芥根系和根尖分生组织的发展，促进分生组织中细胞的周期循环，通过直接抑制H3K4me3的富集，促进H3K27me3的富集，作用于靶基因调控植物生长发育过程[35].本研究中发现了MRG2和BAF60蛋白在植物体内相互作用，而在mrg1mrg2双突变体材料中，BAF60的转录没有发生变化，表明MRG2不影响BAF60基因的转录表达，暗示了MRG2和BAF60蛋白很可能是通过蛋白的协同作用调控基因表达.尽管目前还没有关于MRG2抑制H3K4me3的功能报道，但是人类MRG15早已被报道能够通过去甲基化下调H3K4甲基化水平，维持一个低甲基化状态，维持正常转录[14].拟南芥MRG2是否影响H3K4甲基化修饰是我们以后研究的重点.

此外，我们不仅发现了MRG2和BAF60蛋白间的作用关系，而且还发现了它们共同调控的靶基因IPT3.已有文献报导，BAF60通过抑制H3K4me3，促进H3K27me3以及在IPT3/IPT7基因启动子区域成环的方式抑制IPT3/IPT7基因的表达[35].在mrg1mrg2双突变材料中，qRT-PCR实验和RNA-seq数据库中都显示IPT基因表达上升，MRG2和BAF60都能够负调控IPT基因的转录表达.报道中还指出BAF60调节IPT3/IPT7基因内部区H3K4me3程度，而MRG2已被证明是H3K4me3的阅读蛋白，ChIP实验证明，MRG2正好在IPT3基因内部区富集，这些实验证据也进一步证实了MRG2、BAF60和H3K4me3在调控IPT基因表达的方面具有非常密切的关系.但是，要证明MRG2是否真正参与BAF60调控IPT基因表达的通路仅有以上实验证据是不足的，更需要遗传材料方面的实验证据.在以后的研究中我们需要构建MRG家族与BAF60家族的多突变体遗传材料，统计多方面的植物生长表型数据，从而揭示MRG2与BAF60调控植物生长发育的分子机制.