光信号途径组分HEMERA调控拟南芥的花药发育

王静雅，尚雪莹，李梦雨，马 红，常 芳

(复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所，上海 200438)

被子植物又称为开花植物，其物种数目能占全球总数的67%，重要的原因除了被子植物的双受精机制以外，还因为其能够适应复杂的外界环境.近年的多项研究报道了生长素、油菜素甾醇、甲基茉莉酸等植物激素信号以及高温、干旱等非生物信号均对花药发育产生重要影响.研究植物对环境信号的响应能够丰富植物生长与生殖过程的信号网络，为农作物的分子改良提供重要的理论指导，对于植物的繁衍生息、物种多样性的保护以及农作物的增产都具有至关重要的意义.

花药是被子植物的雄性生殖器官，其正常发育与否直接影响植物繁衍和作物产量.目前依赖于细胞生物学和分子遗传学等手段进行的研究已经明确，花药发育过程包括早期的形态建成、减数分裂和后期的花粉粒发育几个阶段[1-2].拟南芥的花药发育过程能够分为14个时期，在第5期花药完成形态建成，形成具有4个药室的典型结构，且每个药室都由4层体细胞(从外到内分别为表皮层、内皮层、中间层以及绒毡层)包围中央的花粉母细胞构成；花粉母细胞在第6期进行减数分裂并于第7期形成四分体；此后包围四分体的胼胝质被降解、小孢子被释放到药室中，最终发育成为成熟花粉粒并于第13期被释放出来[2-3].这一过程中，绒毡层的正常发育和降解对花药发育至关重要，其能够分泌胼胝质酶促进胼胝质降解、合成孢粉素前体用于花粉壁合成、同时也为小孢子后期发育提供必要的营养和脂类物质[4-7].在花药发育过程中存在多层次信号途径协调互作，以实现对植物生命活动复杂而精确的调控，例如受体激酶BAM1/2、ER/ERL1/ERL2参与调控药室发育及生殖细胞与体细胞的分化[8-10]；受体样蛋白激酶EMS1-SERKs-TPD1组成的受体-配基复合物参与调控绒毡层的形成[11-15]；DYT1-MYB35/TDF1-AMS-MS1遗传通路调控绒毡层发育及功能[16-18]；多肽激素CLE19及其冗余家族成员在花粉外壁形成过程中发挥重要作用[19].同时，高温、干旱等环境信号也是影响植物育性的重要因素[20-22].

光是重要的环境信号，能够引发植物的光形态建成以及调控植物的多个生长发育过程[23].光信号的缺乏或对光信号响应的缺陷会导致植物的形态出现异常.植物破土前在黑暗环境下处于暗形态发生时期，下胚轴会不断伸长，叶片的生长受到抑制；而当幼苗暴露在阳光下后能够响应光信号，完成光形态建成，在此过程中叶片不断生长发育，而下胚轴生长则受到抑制.B类基因(class B genes)是一类特殊的、与拟南芥生长相关的基因，在黑暗条件下，转录因子PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs(PIFs)不断积累，并能够通过激活B类基因的表达从而促进下胚轴的伸长；而在光照条件下，光敏色素Phytochromes(phys)则能够通过促进PIFs的降解以抑制其功能，从而完成光形态建成过程[24-27].近年的研究表明，光信号能够影响植物的开花时间，且光温敏核不育小麦的花药发育也会受到光周期的影响[28-29].但目前对于光信号调控雄性育性的分子机制尚不清楚.本实验室前期利用转录组分析发现有752个光信号途径相关基因在拟南芥4～7期花药中表达,暗示这些基因可能在花药发育中发挥功能[30].

HEMERA(HMR)基因编码一个光敏色素信号途径中的关键元件，已经被报道参与调控拟南芥光信号转导途径，在光形态建成中发挥关键作用[31-33].hmr-5为拟南芥的功能完全缺失突变体，其HMR的N端突变导致翻译提前终止[34].已有研究证实hmr-5的光信号的响应缺陷会导致其叶片出现白化症状且下胚轴持续伸长，幼苗在光照条件下无法完成光形态建成过程[35].使用35S启动子驱动HMR-HA蛋白在hmr-5突变体背景下过表达，能够恢复hmr-5的功能缺陷.此外，HMR蛋白的C端有一段9个氨基酸的序列(9aa TAD)，可能决定了HMR的转录激活功能[36]，该区域定点突变植株hmr-22(D516N)幼苗的生长也出现一定程度的损害，其对红光和远红光的响应程度降低，但对蓝光具有正常的响应[35].进一步的分子机制研究揭示HMR的功能缺失会导致PIFs蛋白的降解过程受阻，且PIFs下游B类基因的表达激活出现异常[31,35].在光照条件下，HMR是PIF蛋白降解过程所必需的，一方面HMR的N端能够直接与转录因子PIF1、PIF3结合，和phys一起介导PIFs的降解过程，最终抑制下胚轴的伸长；另一方面HMR蛋白的C端则通过招募或稳定由基本转录因子(General Transcription Factors, GTFs)、中介体复合物(mediator complex)与RNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ RNA polymerase)组成的转录复合体来促进PIFs下游B类基因的转录激活，最终促进下胚轴的伸长[35].但HMR是否参与到雄蕊发育过程，目前尚未见报道.

基于此，本文以HMR转录激活能力下降的点突变体hmr-22和转基因恢复株系HMR-HA/hmr为材料，分析了HMR在雄蕊发育过程中可能发挥的功能，为深入阐明光信号途径调控植物雄性育性的分子机制奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材料

拟南芥(Arabidopsisthaliana)为哥伦比亚生态型(Columbia)，野生型为Columbia-0(Col-0).突变体包括点突变体hmr-22和转基因植株HMR-HA/hmr[34-35].

1.2 方法

1.2.1 拟南芥突变体DNA的提取与基因型鉴定

采新鲜的拟南芥叶片，使用CTAB法提取其基因组DNA[37].基因型鉴定使用引物见表1，扩增后选取电泳条带清晰明亮的样品使用NanoDrop超微量紫外分光光度计测量其DNA浓度，将达到要求的样品送至公司测序.测序结果使用拟南芥TAIR网站(www.arabidopsis.org)的BLAST功能进行比对分析.

表1 实验用引物信息Tab.1 Primers used in experiment

1.2.2 亚历山大红染色观察

取刚刚露白的花朵(约为花药发育的11～12期)浸泡于卡诺固定液中于4℃保存.观察时，在体视显微镜(Motic Discovery.V8)下剥掉花瓣及花萼后放置于亚历山大红染液(Solarbio G3050)中，65℃染色20min后取出，放置于载玻片上，使用解剖针尖分离花药，注意不要弄破花药，制片后放置在显微镜(Zeiss Axio Scope A1)下观察花药的大小和花药中花粉粒的活性并拍照.

1.2.3 花序树脂包埋

摘取拟南芥新鲜植株的花序，将开放的花朵去除，放入装有FAA固定液的青霉素小瓶中，抽两次真空至花序沉底，后放置于4℃冰箱保存过夜.在小瓶中依次换入浓度为70%、80%、90%、95%的乙醇溶液分别脱水处理1h，后换入100%的乙醇处理2h，再使用加入伊红染料的100%乙醇处理2h使花序着色；在小瓶中换入预渗透液(无水乙醇与Base liquid Technovit 7100等体积混匀)中进行1h的预渗透处理，换入渗透液(1g硬化剂1溶于100mL Base liquid Technovit 7100)中渗透3h.将1mL硬化剂2添加到15mL渗透液后分装入包埋板中并将花序放入包埋板中摆正，放置于65℃烘箱中烘烤36h以上直至样品完全变硬.

1.2.4 半薄切片及染色

使用LEICA RM2265型全自动电动轮转切片机，检查其工作状态，将烘烤完成的包埋块从包埋板中取出并安装到LEICA RM2245型切片机上，制备玻璃刀，调整刀口与包埋块之间的位置与角度后开始切片，切片厚度为1.0μm.在载玻片中央滴加蒸馏水，放置于42℃的烘片台上，使用镊子和针尖将切好的切片从刀口转移到载玻片上.等待切片平展开至没有褶皱，用吸水纸轻轻吸去多余水分，将载玻片放置于65℃烘箱内烘干.将载玻片放入装有1%甲苯胺蓝染色液的玻璃染缸中染色1min左右，用蒸馏水冲洗干净后盖上盖玻片放置于显微镜(Zeiss Axio Scope A1)下观察并拍照.

1.2.5 花粉体外萌发实验

配置花粉体外萌发培养基，加入琼脂后加热，用移液枪趁热将培养基滴入凹面载玻片中.摘取露白花苞，除去花瓣和雌蕊，轻轻将雄蕊沾在培养基上.将载玻片放置于湿盒中，湿盒底层加蒸馏水.放置于22℃避光培养4～8h后使用显微镜(Zeiss Axio Scope A1)观察，统计萌发的花粉比例.

2 结果与分析

2.1 转录组分析结果

为了了解HMR是否可能在生殖发育过程中发挥功能，我们首先分析了HMR在不同营养和生殖阶段的表达情况.The Bio-Analytic Resource for Plant Biology公共数据库(http: ∥bar.utoronto.ca/)中的数据结果显示，在23个营养器官中，HMR主要在茎尖和莲座叶等器官中具有比较高的表达水平(图1(a))；而在生殖过程中，HMR在茎尖分生组织、花序、第9期的花、第10～11期的花、第12期的花中呈现高水平表达(图1(b))，表明HMR在这些过程可能发挥重要作用.

继而，我们依据本课题组及其他课题组已发表的转录组数据[22,38-39]，着重分析了该基因在雄性生殖发育相关组织器官中的表达.结果表明HMR在第1～9期的花(Early Flowers)、第10～12期的花(Late Flowers)、第4～7期的花药(Anther 4～7)、第4～10期的花药(Anther 4～10)中都有较高水平的表达(图1(c))，暗示其在花药发育过程中可能发挥功能.此外，为了明确HMR是否在CLE19、AMS、BAM3、BES1、DYT1、bHLH010/089/091这些花药发育核心调控元件的下游发挥功能，我们还基于本课题组转录组数据，分析了HMR在这些相关单突变体、双突变体和三突变体花药转录组中的表达变化情况[40-41](本课题组部分转录组数据尚未发表).结果表明HMR在上述相关突变体中的表达变化幅度都不超过2倍(图1(d))，暗示其RNA表达水平不受这些基因的调控.

2.2 hmr-22纯合植株的鉴定与序列比对

为了保证所使用的突变体为纯合植株，我们首先对植株进行了基因型鉴定，对突变体和野生型植株提取基因组后，使用表1中的引物进行扩增并送测序，使用TAIR网站的BLAST功能比较突变体与野生型植株HMR基因序列的差别，确认点突变位置(D516N)，且测序峰图中突变位置对应的峰为清晰的单峰，说明突变体为纯合hmr-22植株，可以用于后续研究.

2.3 植株形态与育性分析

我们观察了WT、hmr-22纯合突变体及35S启动子驱动的转基因恢复植株HMR-HA/hmr的生殖发育情况(图2(a)).野生型的植株生长正常，能够形成较多饱满的长角果；相比之下，hmr-22纯合突变体抽苔时间显著更晚，植株更矮、果荚短；而转基因恢复植株HMR-HA/hmr果荚的大小和育性与野生型无明显差异.进而，我们分别统计了野生型、hmr-22、HMR-HA/hmr3种基因型植株主苔的平均果荚数以及每个果荚内产生的种子数目.结果表明: 和野生型及转基因恢复植物相比，hmr-22突变体中产生的果荚数目以及每个果荚中的种子数目均显著减少(图2(b)、(c)).以上结果说明HMR对于植物的营养生长过程与生殖生长过程均有较大影响，且HMR功能缺失导致植株育性下降，暗示它在生殖发育过程中可能发挥重要作用.

2.4 花药亚历山大红染色观察花粉粒活性

为了明确HMR基因是否在花药发育过程中发挥作用，我们对突变体的花药进行了亚历山大红染色，通过观察花药的形态、花粉粒的数量以及花粉粒的活性进一步明确hmr-22的雄性生殖发育表型.染色结果显示野生型花药经过染色后，4个饱含红色活力成熟花粉粒的药室清晰可见(图3(a))，相比之下，hmr-22花药虽然仍有正常的4药室结构，但花粉粒的数量与野生型相比有比较明显的下降(图3(b))；而在转基因植株HMR-HA/hmr中花药中的花粉数量与野生型相近，未见明显异常(图3(c)).以上结果表明hmr-22突变体的雄性发育过程存在缺陷，进一步暗示了HMR可能参与调控花药的发育过程.

2.5 半薄切片观察突变体花药细胞结构

为了进一步探究HMR在花药发育中发挥功能的时期及细胞层，我们采用半薄切片的方法对突变体花药的发育过程和组织结构进行观察，结果如图4所示.野生型花药在第5期时花药形成了由外到内的表皮层、内皮层、中间层、绒毡层4层体细胞包围着中央生殖细胞的典型形态特征(图4(a))；在第7期花药药室中能清晰地看到小孢子母细胞减数分裂形成的由4个单核花粉粒形成的四分体(图4(b))；第8期时小孢子从四分体内释放到花药的药室中(图4(c)).相比而言，hmr-22的花药发育表型在第8期之前与野生型基本一致，各个细胞层分化正常(图4(f)、(g)、(h)).

花药发育的后期为小孢子发育为花粉粒的阶段，随着花粉粒逐渐成熟，花丝不断伸长以将花药举高，而提供营养物质的绒毡层细胞则会在第10期开始发生程序性死亡而逐渐降解，至第12期降解完全(图4(d)、(e)).半薄切片结果显示，在这一发育阶段hmr-22的花药结构与野生型相比出现了明显的异常，野生型花药的绒毡层细胞于第10～11期正常降解，而在hmr-22突变体中可观察到绒毡层细胞的提前降解(图4(i))，最终导致突变体第12期产生的花粉粒出现异常的空泡化而败育(图4(j)).而回补株系HMR-HA/hmr的切片结果显示，其花药发育过程正常，与野生型相比无较大差异(图4(k)～(o)).同时，hmr-22突变体花粉在12期与野生型和转基因恢复株系相比，花粉着色比较浅，且半数花粉空泡化，说明花粉发育及脂类物质合成可能不足(图4(j)).以上结果暗示HMR功能异常影响了花粉发育过程.

2.6 体外萌发实验观察花粉萌发率

亚历山大红染色及半薄切片结果均证明hmr-22突变体的花药发育出现异常，导致败育花粉的形成.但我们仍然可以观察到相当数量形态、活力正常的花粉.但这些染色正常的花粉是否具有正常萌发的能力呢？因此我们取第13期开放的花，将其花粉粒铺于固体萌发培养基上，进行体外萌发实验.多次重复的实验结果显示，野生型植株与HMR-HA/hmr转基因的花粉粒体外萌发率接近50%，而hmr-22突变体花粉粒的萌发率则显著降低至不足20%(图3(d))，表明HMR基因功能异常影响了花粉活力和花粉萌发能力.这一结果和半薄切片中观察到花粉着色浅及空泡化是吻合的.

3 讨 论

雄蕊的正常发育是被子植物产生正常可育花粉粒的前提，也是植物正常完成双受精作用而繁衍后代的基础，探究其发育过程及调控机制对于生殖发育基础理论研究及针对农作物的遗传改良都具有重要意义.之前在模式植物拟南芥和水稻中进行的系列研究揭示了众多调控雄性生殖发育的植物内在调控基因以及环境因子，比如高温、干旱等.不同于动物面对胁迫条件可以逃避，植物无法移动，只能通过多种信号转导途径适应外部环境、调控自身生长发育过程.因此探究植物生长发育过程中对环境信号的响应是非常重要的.

植物的生长发育不仅受到遗传物质的控制，也受到各种环境信号的调节，因此，植物的发育过程需要各种复杂的信号通路之间存在多层次的协调作用，以感知环境信号，实现对植物生命活动复杂而精确的调控，维持植物生长、繁殖与抵抗逆境之间的平衡，使生命活动的效率达到最大化.因此，一个基因同时参与调控多个生物学过程，是重要而有意义的.在众多的环境因素中，光信号对于植物的发育起着至关重要的作用.一方面，光是植物的重要能量来源，另一方面，光也是调控包括生殖发育在内的植物发育过程的重要信号，光周期极大地调控了拟南芥的开花过程.但是目前我们对于哪些基因参与了光信号对于植物生长发育的调控过程依然所知甚少，对于这些基因在生殖方面的功能更知之甚少.光信号通路的HEMERA(HMR)基因被报道在光敏色素介导的红光/远红光信号途径中发挥重要的调控作用，对植物的光形态建成具有重要意义.但其是否参与调控生殖发育尚不清楚.

本研究采用C端9aa TAD序列的点突变体hmr-22、野生型拟南芥Col-0以及转基因恢复株系HMR-HA/hmr作为材料，通过对植株形态、果荚数量及长度、花药育性、花药发育过程、花粉萌发情况进行细致观察和统计分析，明确了HMR功能异常会影响植物的生殖发育过程，并且发现这种影响是由于花药绒毡层的后期形态和功能、花粉发育以及花粉萌发力均出现异常的综合结果.此前没有光信号中光敏色素相关基因在植物生殖发育过程中的功能研究报道，本文首次证明了光敏色素B信号途径重要组分HMR参与调控拟南芥雄性生殖发育的过程.这一研究不仅揭示了光敏色素途径在调控植物雄性育性中的功能，也为进一步深入研究其作用机制和信号转导途径奠定了基础.同时，这一方向的深入探究对于理解植物生殖发育的平衡以及指导农业生产具有重要意义.