人脐带间充质干细胞来源的外泌体通过circHIPK3促进心梗修复

张雨晴，王燕丽，严 兵，张 瑜，谢文萍，刘 冯，李杨欣

(1. 苏州大学 心血管病研究所，江苏 苏州 215000; 2. 苏州大学 附属第一医院心脏大血管外科，江苏 苏州 215006)

急性心肌梗死是由于人为或非人为因素，导致冠状动脉处发生快速、且持续性的缺氧缺血现象，最终引发心肌坏死，是临床上常见的急症之一.因其死亡率高且预后较差，对人们的健康已经造成了严重的威胁.目前治疗心肌梗死的手段多样化，主要包括药物治疗、冠状动脉旁路及介入治疗、干细胞移植治疗等.药物治疗、冠状动脉介入等常规治疗，虽然在一定程度上缓解了患者的痛苦，但是都不能从根本上恢复受损的心肌.最新研究表明，干细胞移植治疗作为一项新兴的临床前沿技术，将干细胞注射到梗死后的心肌组织，可以增加有活性的心肌细胞数量，促进血管新生来改善心脏血流供应，从而改善受损的心功能.作为一种多能干细胞，间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell, MSC)具有高度的自我更新、多向分化潜能，且来源广泛，可在体外培养快速扩增，是干细胞治疗来源的首选种子细胞.目前基础研究表明，MSC细胞主要通过旁分泌作用来修复梗死的心脏[1-2]，且临床试验已经证实MSC细胞具有良好的安全性与有效性[3-4].但是MSC细胞本身因其滞留率低、细胞存活率低的问题仍然是干细胞在临床应用过程中所面临的主要障碍[5]，因此，基于无细胞的“干细胞”替代性治疗才是首选策略[6-8].

外泌体(exosome)是由细胞分泌，直径在30～100nm之间的脂质膜性囊泡，作为一种传递生物信息的载体，在免疫应答、细胞凋亡、血管生成、炎性反应等生理病理过程中均发挥一定作用.研究发现干细胞分泌的exosome可减少缺血环境下心肌细胞凋亡，同时促进心肌细胞、血管内皮细胞的增殖、分化等[9-10].exosome的心肌保护效果逐渐崭露头角，同时其在心肌修复、血管新生中的机制也成为研究的重点环节,在热休克蛋白家族相关通路、凋亡蛋白家族调控机制及非编码RNA(ncRNA)传输和调控等方面扮演的角色也越来越重要,为心肌梗死提供了一种全新的生物分子治疗方式[11-12].

环状RNA(circRNA)是继微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)之后新兴的一种内源性ncRNA，在最近几年逐渐受到广泛关注,是目前RNA研究的热点.与线性RNA显著不同，circRNA主要以环状结构存在，且不容易被核酸外切酶降解，表达更加稳定，半衰期也较长.且越来越多的研究者发现，circRNA在心血管疾病的发生发展过程中发挥着一定的作用,它在调控心血管疾病中具备的巨大潜能,提示其在临床诊断和治疗方面将具有更广阔的应用前景[13-14].已有研究证明：exosome相比于其来源细胞，含有更丰富的circRNA[15]，但是外泌体中circRNA的功能研究甚少，几乎没有文献涉及，因此探究exosome中circRNA的调控作用也将会具有更大的临床研究价值.

近来发现circHIPK3在肝细胞癌、非小细胞肺癌等疾病模型中表达水平较高，能够促进细胞生长[16].但其在受损心肌修复、心脏保护及再生等方面中的作用及其调控机制却鲜有文献报道.因此本研究拟探讨exosome中的环状RNA circHIPK3对心梗后心肌修复与再生方面的影响,并进一步研究其调控的分子机制.

1 材料与方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠，雄性，8～12周龄，18～22g，用于心梗模型的制作，购买于昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，目前在苏州大学动物实验中心饲养.人脐带间充质干细胞(Umbilical cord MSC, UMSC)购于江苏和泽生物有限公司.实验所用的H9C2细胞购买自美国模式培养物集存库(ATCC)；实验中涉及的siRNA试剂及引物均由广州市锐博生物科技有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及细胞处理

UMSC细胞生长需要的完全培养基由4种成分组成：α-MEM basic基础培养基，20%的胎牛血清FBS，双抗(100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素)，L-谷氨酰胺.H9C2细胞生长需要的完全培养基由4种成分组成：DMEM basic基础培养基，10%的胎牛血清FBS，双抗(100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素)，L-谷氨酰胺.细胞均培养在37℃，含有5%CO2的细胞恒温培养箱中.每2天更换1次细胞培养液.低氧处理组细胞培养在37℃，含有5%CO2与1% O2的细胞恒温培养箱中.

H9C2细胞凋亡模型的构建：实验共分为3组，PBS处理组、exosome处理组、si-circHIPK3 exosome处理组.待细胞密度达到60%～70%左右时，将DMEM完全培养基更换为DMEM无血清培养基，同时在培养基中分别加入等量的exosome，放入低氧培养箱中培养48h，之后收集细胞，进行TUNEL染色，检测细胞凋亡.

1.2.2 exosome的收集与鉴定

1.2.2.1 exosome的收集 取生长状态良好的P3代UMSC细胞，用含10%Exo-free FBS的α-MEM完全培养基，培养细胞48h后，收集培养上清.2000g离心20min，弃细胞碎片.之后向细胞上清中加入1/2倍体积的exosome分离试剂进行浓缩，上下颠倒，充分混匀，置于4℃冰箱浓缩过夜.第2天，对浓缩混合液进行10000g，4℃离心1h，弃净上清，用适量1×PBS重悬exosome沉淀，置于-80℃保存.

1.2.2.2 流式细胞术鉴定exosome表面CD63的表达 通过BCA蛋白浓度定量试剂盒对exosome浓度进行测定，取10μg exosome用于流式鉴定.具体操作如下：

① 在10μg的exosome悬液(EP管)中加入10μL乳胶微球颗粒，移液枪缓慢吹打混匀，室温孵育15min；

② 向EP管中加入1×PBS至1mL，室温继续孵育2h.孵育期间使用移液枪不间断进行缓慢吹打混匀，使乳胶微球颗粒能够与exosome充分混合；

③ 2h之后，向EP管中加入一定量体积的甘氨酸(1mol/L)，使其工作浓度达到0.1mol/L，移液枪缓慢吹打混匀，室温孵育30min；

④ 4000r/min离心3min，弃上清.通过0.5%BSA溶液清洗2次exosome沉淀；

⑤ 100μL 0.5%BSA溶液重悬exosome，随后加入10μL CD63抗体(FITC标记，Abcam，美国)，4℃避光孵育30min；

⑥ 通过0.5%BSA溶液继续清洗exosome沉淀2次；

⑦ 向exosome沉淀中加入200μL 0.5%BSA溶液，移液枪缓慢吹打重悬exosome，使用流式细胞仪(Guava)进行检测.

1.2.3 EdU染色检测细胞增殖

使用EdU增殖检测试剂盒检测细胞增殖.以每孔5×104的密度将处于对数生长期的H9C2细胞铺板于24孔板中，待细胞密度达到60%左右时，将circHIPK3 siRNA与lip2000以1∶1的比例混匀在DMEM基础培养基中，转染H9C2细胞，6h后更换成DMEM完全培养基，48h后，EdU染色检测细胞的增殖情况.具体染色步骤如下：

① 吸除旧培养基，每孔中加入50μmol/L EdU的培养基(200μL)，孵育2h，弃除培养基；PBS清洗2～3次，5min/次；

② 每孔中加入4%多聚甲醛细胞溶液(200μL)，固定细胞，室温孵育30min，弃除固定液；

③ 每孔中加入2mg/mL甘氨酸溶液(200μL)，孵育5min(摇床)，弃除甘氨酸溶液，之后PBS摇床清洗5min，弃除PBS；

④ 每孔中加入0.5%TritonX-100溶液(200μL)，孵育10min(摇床)，之后PBS清洗5min；

⑤ 每孔中加入1×Apollo©染色液(200μL)，室温避光孵育30min(摇床)，弃除染色液；加入0.5%TritonX-100溶液(100μL)，摇床清洗2～3次，10min/次，弃渗透剂；

⑥ 每孔中加入甲醇(200μL)清洗1～2次，5min/次；PBS清洗5min；

⑦ 每孔中加入1×Hoechst 33342染色反应液(200μL)，室温避光孵育30min(摇床)，弃除染色液；之后每孔中加入100μL PBS清洗1～3次；最后荧光显微镜(IX51)下观察.

1.2.4 Annexin V检测细胞凋亡

使用Annexin V-FITC细胞凋亡流式检测试剂盒(BD Pharmingen)检测细胞凋亡情况.取100μL的1×Binding Buffer重悬细胞制备细胞悬液(105/mL)，向细胞悬液中分别加入5μL Annexin V-FITC抗体和5μL PI，室温避光染色15min.然后补加400μL的1×Binding Buffer缓冲液，轻轻混匀，之后上机检测.

1.2.5 TUNEL染色

使用TUNEL染色试剂盒(Vazyme)检测细胞凋亡.以5×104/孔的密度将处于对数生长期的H9C2细胞铺板于24孔板中，待细胞密度达到60%左右时，用400μg/mL的exosome培养基进行培养，48h后，

表1 引物列表Tab.1 List of primers

细胞进行固定、通透后，每孔中加入50μL左右的TdT孵育缓冲液，37℃避光孵育60min，之后用PBS摇床清洗5min后，进行DAPI染色，室温染色5min，即可通过荧光显微镜对细胞的凋亡情况进行观察.

1.2.6 Real-time PCR

取贴壁或悬浮细胞，直接通过TRIzol试剂(TaKaRa)对细胞进行裂解，提取细胞中总RNA，之后使用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒进行反转，最后通过SYBR Premix Ex Taq Kit(TaKaRa)试剂盒进行实时荧光定量PCR实验，检测目的基因的表达.引物序列如表1所示.

1.2.7 统计学分析

2 结 果

2.1 circHIPK3在外泌体及心肌梗死中表达

为了探究circHIPK3在UMSC细胞来源exosome中的作用，我们首先通过原子力显微镜对UMSC细胞进行形态学观察，并对其来源的exosome进行提取鉴定.如图1(a)所示，UMSC细胞形态比较均一，呈典型梭形.原子力显微镜结果发现，UMSC细胞核显著凸起，表明细胞增殖能力较强(图1(b)).随后，我们通过超速离心法，对UMSC来源的exosome进行了分离，并利用流式细胞术鉴定exosome中的标记物CD63蛋白分子的表达(图1(c)).通过qPCR对不同培养时间下UMSC细胞及其来源exosome中circHIPK3的表达水平进行检测，结果显示UMSC细胞与exosome中circHIPK3的表达存在一定的正相关性.即UMSC细胞中circHIPK3表达水平较高时，其对应的exosome中也相对较高，且每个时间点下外泌体中的circHIPK3均高于细胞中的circHIPK3.其中在12h时，UMSC及exosome中circHIPK3的表达水平最高(图1(d)).但是由于12h时UMSC细胞所分泌的exosome量相对较少，因此本论文中我们采用了48h作为UMSC细胞的培养时间点，用于收集exosome.同时，我们也分别对心肌梗死1，3，7d后小鼠的缺血心肌进行RNA提取，检测circHIPK3的表达变化，发现circHIPK3在心肌梗死发生第1天下调最为明显，具有显著的统计学意义(图1(e)).

2.2 exosome通过circHIPK3促进心肌梗死修复

为了探究exosome中高表达的circHIPK3是否对心肌梗死具有治疗作用，我们针对circHIPK3接头处序列设计了3对siRNA,并通过qPCR对siRNA转染后的UMSC细胞,分别进行circHIPK3、线性HIPK3的表达水平检测.结果如图2(b)所示：siRNA处理后，UMSC细胞中circHIPK3的表达显著下调，而线性HIPK3的表达并未发生显著变化(P>0.05).同时收集si-circHIPK3转染UMSC细胞后所分泌的exosome，进行circHIPK3表达水平的检测，发现exosome中circHIPK3的表达也是显著降低(图2(c)).紧接着我们通过构建小鼠心肌梗死模型，心肌注射20μL PBS、100μg exosome、si-circHIPK3 exosome(5μg/μL，共计20μL，分5点依次注射)，并于心梗后1，3，7，14，28d，通过超声系统检测了不同处理组小鼠的心脏功能恢复情况.结果显示术前和心肌梗死术后1d LVEF在3组间无明显差异.但是在心梗手术后第7天，和si-circHIPK3处理组与PBS对照组相比，exosome处理组的LVEF明显增加(图2(d、e、f)).Massson染色结果也显示：si-circHIPK3处理组心脏纤维化面积显著高于exosome处理组(图2(g))中，表明exosome通过传递circHIPK3，促进心梗修复.

2.3 circHIPK3通过抑制心肌细胞凋亡修复心肌梗死

为探究circHIPK3如何发挥修复心肌梗死的作用，我们首先对转染si-circHIPK3的H9C2细胞进行了EdU染色，(图3(a))染色结果显示下调circHIPK3明显抑制心肌细胞的增殖.紧接着，将PBS、exosome、si-circHIPK3 exosome分别在低氧环境中与H9C2细胞共培养48h，继而通过TUNEL染色与流式检测H9C2细胞的凋亡情况.结果显示：与正常exosome组相比，si-circHIPK3 exosome组的保护作用明显减弱(图3(b、c、d)).由此可见，exosome中的circHIPK3通过抑制心肌细胞凋亡的发生，从而促进心肌梗死后的修复.

3 讨 论

我们的实验结果表明circHIPK3在UMSC及其来源的exosome中表达较为丰富，且在小鼠心肌梗死后的心脏中显著下调.所以我们通过设计3对si-circHIPK3来下调UMSC来源的exosome中的circRNA，结果证明了exosome可以通过递送circHIPK3，抑制心肌细胞凋亡，促进心肌梗死后受损心肌的修复与再生.

旁分泌作用是间充质干细胞发挥治疗作用的主要途径，而exosome作为旁分泌的主要成分之一，包含mRNA、miRNA、circRNA、蛋白质等多种功能性的分子，不仅参与调控细胞的增殖与存活，在信号传递、细胞交流中也同样发挥着重要的作用[17].目前已经有很多研究报道表明间充质干细胞来源的exosome能够促进心肌梗死后的心脏修复[18-20]，但是目前还不清楚exosome究竟能否完全代替间充质干细胞来进行心脏修复.且间充质干细胞来源的exosome介导心脏修复的分子机制目前还有待深入探究与完善,尤其是在circRNA调控方面，更是一片空白.我们的研究方向正好填补了这方面的机制空缺，为临床治疗提供了新的探究视野.

circHIPK3是由HIPK3基因第二外显子编码而来，主要定位于细胞质中.文献[16,21]的研究发现，在肝癌细胞中，circHIPK3通过竞争性结合多种miRNAs，继而促进肝癌细胞增殖与迁移.文献[22]系统性地分析了circHIPK3在糖尿病视网膜血管功能中的作用，发现circHIPK3通过竞争性结合miR-30a-3p继而促进其下游基因VEGF/WNT2/FZD4的表达，促进内皮细胞增殖.由此表明circHIPK3具有促进细胞增殖、迁移与调控血管功能的作用.但是circHIPK3在心脏功能方面的调控作用，还未有文献报道.本研究中通过体内体外模拟心脏缺血环境，设计针对circHIPK3序列的siRNA分子，探究发现circHIPK3不仅具有促进心肌细胞增殖的功能，还能够显著降低细胞的凋亡率，同时改善受损心脏，促进心脏组织再生.

总之，我们的实验结果表明，UMSC细胞来源的exosome，通过输送circHIPK3,抑制心肌细胞凋亡，促进心肌梗死修复，对心脏组织再生修复及临床应用提供了很好的借鉴思路.但是本研究并未涉及到circHIPK3抑制心肌细胞凋亡、促进心脏修复与再生的具体机制，这点需要后续更进一步的探究.