4-苯基丁酸早期处理对脓毒症大鼠血管通透性的保护作用

朱 娱，刘良明，张 杰，吴 跃，田昆仑，彭小勇，向鑫明，李 涛

脓毒症是临床严重烧伤、创伤、革兰氏阴性菌感染的主要并发症[1]，血管通透性增加是脓毒症重要的病理生理过程。在脓毒症的发生发展过程中，由于微血管通透性增加，引起周围局部组织水肿，导致有效循环血量减少，是引起多种重要器官功能障碍的主要原因[2-3]。目前针对脓毒症血管通透性增加发生机制和防治措施有大量研究，但至今仍未找到有效防治措施，因此，寻找脓毒症血管通透性变化的防治措施，对临床严重烧伤、脓毒症器官功能障碍的防治有重要意义。

内质网应激是由多种因素致内质网环境改变，从而引起蛋白质的错误折叠，导致细胞损伤的病理过程。内质网处于严重或长期应激将激活细胞凋亡信号触发细胞死亡。大量研究发现，内质网应激与多种疾病的发生发展有着密切的关系，如神经退行性疾病、脑缺血再灌注损伤和代谢性疾病[4-6]等。4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，PBA)是内质网应激的抑制剂，是分子量较小的芳香族脂肪酸，目前PBA已被批准用于临床治疗尿素循环障碍患者[7]。据报道，PBA可抑制内质网应激，具有抗炎作用效应[8-9]。实验室及其他研究发现，脓毒症后多个器官组织存在内质网应激，PBA是否对脓毒症血管渗漏功能有保护作用，目前不清楚。为此，笔者用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)复制大鼠脓毒症模型，观察PBA早期处理对脓毒症大鼠血管通透性的保护作用，并初步探讨其保护机制。

材料与方法

1 实验动物

SPF级成年SD大鼠，雌雄各半，12周龄，(220±20)g左右，由陆军军医大学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(渝)20170002，使用许可证号为SYXK(渝)20170002。

2 药品与试剂

异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate，FITC-BSA)购自美国Sigma公司，货号A9771；PBA购自美国Sigma公司，货号P21005；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)购自美国Sigma公司，货号L2630；ZO-1抗体购自中国博士德公司，兔抗大鼠，抗体使用浓度1∶200。

3 仪器

F4500荧光分光光度计(日本日立公司)；SP5 II激光共聚焦显微镜(德国莱卡公司)；BX51W1微循环显微镜(日本OLYMPUS公司)。

4 方法

4.1大鼠脓毒症模型制备及分组

取SD大鼠，3%戊巴比妥钠行腹腔麻醉，根据本实验室已建立的方法复制脓毒症模型[9]，即CLP。随机分为常规治疗组、PBA早期处理组、脓毒症组和假手术组(5mg/kg PBA)，每组8只。常规治疗组：根据脓毒症救治指南[1]，在CLP 12h后静脉给予乳酸林格氏液(Lactate Ringer’s solution，LR)、抗生素头孢呋辛钠(100mg/kg)和血管活性药物多巴胺(输注速度10μg/kg·min)，输注3h，使MAP>65mmHg；PBA早期处理组：在CLP手术完成后立即尾静脉给予PBA(5mg/kg)，在CLP 12h后进行常规治疗3h；脓毒症组：在CLP 12h后放置3h再检测相关指标；假手术组除了不结扎盲肠和穿孔以外，其他操作与脓毒症组一致。

4.2肺和肾血管通透性测定

大鼠麻醉后仰卧固定，颈静脉插管，稳定后按照9mg/kg经颈静脉注射FITC-BSA，待FITC-BSA循环2h后，从颈静脉匀速注射稀肝素40mL，结扎腹主静脉，剪断腹主动脉，冲洗至肺脏和肾脏变白，取左肺上叶和整个左肾，称重，剪碎组织，匀浆，在离心力8 000g，4℃下离心10min，取上清液，用荧光分光光度计测定组织的吸光度(激发波长500nm，发射530nm)，同时使用多功能酶标仪测定组织匀浆液的吸光度，并计算匀浆液中荧光白蛋白浓度和总蛋白浓度。以组织上清液荧光白蛋白浓度/总蛋白浓度代表肺脏和肾脏的血管通透性。

4.3肠通透性测定

采用伊文思蓝法检测大鼠小肠通透性[10]。迅速处死大鼠后，在距胃端6～7cm处取一段约6cm小肠，用磷酸缓冲液(PBS)轻轻冲洗干净肠腔后，将小肠两端用线栓起制成肠囊，肠囊中注射有200μL 1.5%伊文思蓝，置于37℃水浴2h后，打开肠囊，生理盐水冲洗肠腔至冲洗液澄清，然后在50℃烤箱中烘烤24h，称取肠干重，加2mL甲酰胺溶液置于37℃ 24h，在分光光度计上检测波长655nm的吸光度，计算出每克肠干重所含伊文思蓝含量(mg/g)。

4.4肠系膜微血管通透性检测

沿腹直线作2～3cm切口，轻轻提出小肠(距回盲部10～15cm)，并将小肠展开放在观察板上，连续滴加37℃生理盐水保持小肠的温度和湿度，用配有37℃恒温装置的生物显微镜(OLYMPUS，BX51W1)进行观察；选择直径30～50 μm、200μm长且无分支、无明显弯曲的肠系膜微静脉，通过连接在显微镜上的CCD彩色摄像机(OLYMPUS，DP21)在显示屏上观察，记录尾静脉注射FITC-BSA (9mg/kg)1、3、6min和12min后微血管的通透性变化。

4.5闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)的测定方法

取血管内皮细胞消化成单个细胞，然后接种至激光共聚焦培养皿，细胞长至80%密度时使用4%多聚甲醛固定15min，用PBS在摇床上洗(5min×3次)；0.1% Triton破膜1min，PBS洗(5min×3次)；1%牛血清白蛋白(BSA)封闭10min，PBS洗(5min×3次)；加一抗(1∶200)，4°C过夜，PBS洗(5min×3次)；二抗室温避光孵育1h，PBS洗(5min×3次)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)避光孵育10min，PBS洗(5min×3次)，使用激光共聚焦显微镜观察。

4.6单层内皮细胞荧光白蛋白透过率测定

接种内皮细胞于Transwell中，培养到细胞长满单层后，Transwell上腔中加入20μL FITC-BSA，混匀后于10、20、40、80min和120min分别从下腔取出200μL 培养基于96孔板中测定荧光值，以所测出96孔板中的荧光值/20μL FITC-BSA总的荧光量反映透过率。

4.7统计学方法

结 果

1 PBA对脓毒症大鼠平均动脉压的影响

假手术组大鼠的平均动脉压为(112.0±5.3)mmHg，脓毒症组为(62.0±7.1)mmHg，与假手术组比较，降低了44.6%，差异有统计学意义(P<0.001)；常规治疗组可将平均动脉压维持在(80.0±10.2)mmHg左右，与脓毒症组比较，差异有统计学意义(P=0.001)；PBA早期处理后，大鼠的平均动脉压可恢复到正常的87.0%，与常规治疗组比较，差异有统计学意义(P=0.003)。见图1。

图1各组大鼠平均动脉压的变化。sham：假手术组；sep：脓毒症组；CT：常规治疗组；PBA：PBA早期处理组(5mg/kg)。与假手术组比较：*P<0.01；#与脓毒症组比较，P<0.05；与CT组比较：ΔP<0.01

2 PBA对脓毒症大鼠肠系膜微血管通透性和肠屏障功能的影响

为观察PBA对脓毒症大鼠肠屏障功能的保护作用，分别采用肠腔用伊文思蓝法测定肠组织的通透性和CLP12h后直接注射FITC-BSA，观察肠微血管的通透性。结果发现：假手术组肠系膜微静脉在FITC-BSA作用12min无明显差异；脓毒症组的肠系膜微静脉从注入FITC-BSA 1min后开始从血管往组织渗漏，并且随着FITC-BSA作用时间延长，渗漏到组织间隙越多，到FITC-BSA作用12min时，整个视野都散布着FITC-BSA；PBA早期处理组随着FITC-BSA作用时间延长，也有部分渗漏，但是渗漏到组织间隙的FITC-BSA显著少于脓毒症组(图2)。伊文思蓝结果发现：脓毒症组大鼠的肠组织明显渗漏，与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.001)；常规治疗后肠道的通透性有部分改善(P=0.010)；PBA早期处理可明显降低肠道的通透性，与常规治疗组比较，差异有统计学意义(P<0.001)。见图3。

图2PBA早期处理对脓毒症大鼠肠系膜微血管通透性的影响

图3 肠组织通透性。sham：假手术组；sep：脓毒症组；CT：常规治疗组；PBA：PBA早期处理组(5mg/kg)；1、3、6min和12min是FITC-BSA注射后的时间；与假手术组比较：*P<0.01；与CT组比较：#P<0.01

3 PBA对脓毒症大鼠肺脏和肾脏血管通透性的影响

脓毒症后，大鼠的肺脏和肾脏血管渗漏显著增加，与假手术组比较，差异均有统计学意义(P<0.001)；常规治疗后肺脏和肾脏血管通透性有部分改善(P=0.005)；PBA早期处理可显著降低肺脏和肾脏血管的通透性，与常规治疗组比较，差异有统计学意义(P=0.001)。见图4。

图4 PBA早期处理对脓毒症大鼠通透性的影响。a.肺脏通透性；b.肾脏通透性；sham：假手术组；sep：脓毒症组；CT：常规治疗组；PBA：PBA早期处理组(5mg/kg)。与假手术组比较：*P<0.01；与CT组比较：#P<0.05

4 PBA对内皮细胞ZO-1的影响

为了进一步观察PBA对通透性的调节作用，取原代内皮细胞，用LPS刺激，测定内皮细胞ZO-1的表达。结果发现：正常对照组内皮细胞ZO-1连接紧密，结构完整；LPS(2μg/mL)刺激后，内皮细胞形态不规则，细胞间的紧密连接被破坏，呈断断续续分布，细胞间隙增大，ZO-1表达降低，PBA早期处理后内皮细胞形态明显改善，ZO-1表达增加，形态较为连续清晰。见图5。

图5 PBA对内皮细胞ZO-1的影响。N：正常对照组；LPS：2μg/mL LPS处理细胞24h；LPS+PBA：PBA(5μmol/L)作用4h后，给予LPS作用24h；ZO-1：内皮细胞连接蛋白；DAPI：细胞核染料；Merge：ZO-1和DAPI合并图

5 PBA对单层内皮细胞荧光白蛋白透过率和TER的影响

与正常对照组内皮细胞比较，LPS刺激能显著增加荧光白蛋白透过率，增加了96.1%(P<0.001)；PBA早期处理可显著降低LPS刺激引起的荧光白蛋白透过率的升高，与LPS组相比，降低了24.8%(P=0.014)。LPS组的TER随着LPS刺激时间延长逐渐降低，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.001)；PBA早期处理内皮细胞后，细胞的TER逐渐升高，与LPS组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

图6 PBA早期处理对单层内皮细胞荧光白蛋白透过率的影响。N：正常对照组；LPS：2μg/mL LPS处理细胞24h；LPS+PBA：PBA(5μmol/L)作用4h后，给予LPS作用24h；Normalized Resistance：标准化的细胞跨膜电阻。与正常对照组比较，*P<0.01；与LPS组比较，∆P<0.05

讨 论

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，其发病率高，病死率高，是ICU病死率最高的疾病之一[11]。血管渗漏是脓毒症患者多器官功能障碍的主要原因。尽管关于脓毒症血管渗漏的研究较多，但由于机制复杂，无针对性的治疗措施，因此寻找有效的治疗药物对脓毒症血管渗漏具有重要的意义。

PBA是美国食品及药物管理局(FDA)批准上市的新药，由于其广泛的药理特性，在多种疾病中发挥着保护作用。如在利用自体血脑内立体定向注射法建立大鼠脑出血模型中，不同剂量的PBA能明显改善脑水肿和血脑屏障的完整性[12]；在逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠溶液建立的大鼠SAP肝损伤模型中，PBA可以明显改善大鼠血清淀粉酶、谷丙转氨酶以及谷草转氨酶的含量，可以改善胰腺病理学评分和肝脏病理学评级[13]；在原代皮层神经元构建的氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤模型中，PBA显著改善OGD/R所导致的神经元存活率下降和细胞凋亡增加[14]，但PBA对脓毒血症所致血管通透性增加是否有作用，目前尚未明确。本研究采用CLP复制脓毒症模型,结果显示，PBA早期处理可明显降低重要脏器血管和肠道通透性，可以增加内皮细胞间的紧密连接并增加内皮细胞TER。提示PBA早期处理对脓毒症大鼠的血管通透性有保护作用。

PBA通过什么分子机制发挥对脓毒症大鼠通透性的保护作用呢？目前研究比较多的是PBA作为内质网应激的抑制剂，发挥分子伴侣活性的作用，协助内质网中蛋白质转录后修饰和折叠，从而减轻ERS所致的损伤[15-16]。笔者以往的研究证实内质网应激在脓毒性休克血管通透性增高起重要作用，而内质网应激抑制剂牛磺酸可以改善内质网应激以及血管通透性[17]。此外，PBA除了对内质网应激有作用外，越来越多的文献显示其对其他信号通路也有作用，如Jian等[18]的研究显示PBA可通过抑制氧化应激损伤而发挥对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，在脓毒症中PBA是否也通过这些通路发挥作用有待于进一步研究。

综上所述，本研究显示PBA早期处理对脓毒症大鼠的血管通透性有保护作用，为脓毒症的治疗提供新的策略，为PBA的临床应用提供新的理论基础。