尼古丁通过抑制JAK/STAT通路对HUVECs增殖和凋亡的影响研究

王思雯，张珺，马君，张璐

吸烟是影响多种疾病发生的风险因素，包括肺癌、高血压、动脉硬化、胃部疾病和脑部疾病。尼古丁（nicotine）又名烟碱，是烟草中的主要有害成分之一，会直接引起肺细胞凋亡损伤，近年来有研究发现尼古丁会直接影响血管内皮细胞的生长，诱发心脑血管疾病，但是尼古丁对血管内皮细胞的影响效果和机制尚不明确[1-3]。JAK/STAT信号通路是一种快速传递的信号通路，参与激活各种细胞因子与受体结合并参与细胞的增殖、凋亡和分化[4]。本次研究主要分析尼古丁对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）的影响以及对JAK/STAT通路的影响，探究尼古丁对血管内皮细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料HUVECs购自ATCC（美国）。MEM培养基以及胎牛血清购自Gibco（美国）。尼古丁购自Sigma（美国）。CCK-8试剂盒和凋亡试剂盒购自Dojindo（日本）。酶标仪型号ELX 800，公司为Bio-Teck（美国）。流式细胞仪购自BD公司（美国）。JAK、p-JAK、STAT、p-STAT、Bax、Bcl-2和Caspase-3一抗体和二抗均来自Abcam公司（美国）。PVDF膜（Bio-Rad，美国）。PCR引物由Genewiz（苏州，中国）设计和合成。逆转录试剂盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM实时PCR试剂盒购自TaKaRa（日本）。

1.2 细胞分组与培养HUVECs在含有10%的胎牛血清的MEM培养基中培养，培养条件为37℃，5%的CO2，相对湿度95%。将细胞分为对照组、尼古丁1组、尼古丁2组、尼古丁3组，分别在培养基中加入终浓度为0、10-8、10-7、10-6mol/L的尼古丁，培养24 h。

1.3 检测方法

1.3.1 显微镜观察在培养48 h后，使用显微镜观察细胞形态。

1.3.2 CCK-8检测细胞活力CCK-8法被应用于测定细胞活力。将细胞接种于96孔板，加入10 μl CCK-8试剂并在37℃，5%的CO2中培养4 h。使用酶标仪测量每个孔在450 nm处的吸光度（OD）。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡流式细胞术用于检测细胞凋亡情况，细胞洗涤、重悬后分别按照试剂盒说明书加入试剂，通过流式细胞仪检测凋亡率。

1.3.4 Western blot使用Western Blot检测细胞中JAK、p-JAK、STAT、p-STAT蛋白水平。在液氮的保护下裂解细胞，在12000 rpm，4℃下离心15 min收集上清液，使用BCA方法确定蛋白质浓度。使用10%的SDS-PAGE凝胶用于电泳，电泳后使用PVDF膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2 h。加入一抗室温震荡2 h，后在4℃孵育过夜，加入二抗。使用GAPDH作为内参。

1.3.5 PCR使用PCR法检测Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达。细胞裂解后收集总RNA，通过在95℃下激活DNA聚合酶5 min进行PCR，然后进行40个循环（95℃/10 s和60℃/30 s），最终延伸72℃下10 min，保持在4°C，GAPDH作为内参，使用2-ΔΔCT法分析mRNA水平。

1.4 统计学处理实验数据均以平均值±标准偏差（SD）表示。统计分析使用SPSS 19（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）。进行单因素方差分析（ANOVA）以评估实验组之间的差异。统计学显着性表示为P＜0.05。

2 结果

2.1 尼古丁对细胞形态的影响使用显微镜观察尼古丁对细胞形态的影响，结果显示对照组和尼古丁1组中内皮细胞呈现多边形，胞浆丰富，边界清晰，并且细胞排列紧密，呈现铺路石状态。而尼古丁2组细胞出现轻微的萎缩，排列紧密度降低，尼古丁3组的细胞呈现萎缩状态（图1）。

2.2 尼古丁对细胞活力的影响在干预后12 h和24 h，尼古丁可剂量依赖性的抑制HUVECs活力（表1）。

2.3 尼古丁对细胞凋亡的影响尼古丁可以剂量依赖性的促进HUVECs凋亡（表2、图1）。

2.4 尼古丁对JAK/STAT通路的影响尼古丁可显著抑制p-JAK/t-JAK和p-STAT/t-STAT的水平（表3和图2）。

2.5 尼古丁对Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的影响尼古丁可显著的提高Caspase-3和Bax mRNA的水平，抑制Bcl-2 mRNA的水平（表4）。

表1 尼古丁细胞活力的影响

表2 尼古丁对细胞凋亡的影响（%）

图1 干预后24 h流式细胞术检测尼古丁对细胞凋亡的影响

表3 尼古丁对JAK/STAT通路的影响

图2 干预后24h Western blot检测尼古丁对细胞凋亡的影响

表4 尼古丁对Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的影响

3 讨论

心脑血管疾病是影响人类健康的重大疾病，调查显示在全世界范围内，每年死于心脑血管疾病的人数超过1500万人。我国是心脑血管疾病大国，而吸烟是引起心脑血管疾病的主要诱因之一[5]。研究发现吸烟患者的冠心病的发病率显著高于不吸烟者，吸烟不但会提高血液的黏度，还会引起内皮细胞损伤，引起血管内皮功能异常，引起高血压、冠心病、脑梗死等的发病风险[6]。

研究已经发现尼古丁会直接影响肺功能并引起肺损伤[7]。尼古丁在进入集体后会经由血液输送，直接影响血管、心脏以及脑血管，作用于血管内皮细胞，直接影响血管内皮功能。为分析尼古丁对血管的影响，我们使用HUVECs作为研究对象，研究不同尼古丁浓度对细胞的影响。结果显示在高浓度的尼古丁影响下，HUVECs形态发生变化，出现萎缩，并且细胞间排列不紧密。并且进一步的研究结果也显示尼古丁可以剂量依赖性的抑制细胞HUVECs活力，促进HUVECs的凋亡。国内有研究显示尼古丁会通过调节自噬影响血管内皮细胞功能[8]。吴雨径等[9]研究也发现尼古丁可以抑制HUVECs增殖。国外也有研究显示尼古丁可通过Akt通路诱导HUVECs凋亡[10]。这提示尼古丁会降低HUVECs的活力并诱导其凋亡。

为进一步研究尼古丁影响HUVECs的机制，我们分析不同尼古丁浓度下培养24 h后JAK/STAT通路和凋亡蛋白的影响。JAK受到环境或其他刺激被激活后，使STAT的酪氨酸磷酸化，并且STAT会进入细胞核直接调节靶基因的表达[11]。JAK/STAT通路的激活会直接促进促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达并抑制Bcl-2 的表达[12]。本次研究结果显示尼古丁可显著的抑制HUVECs的p-JAK/t-JAK和p-STAT/t-STAT的水平，并且尼古丁可显著的提高Caspase-3和Bax mRNA的水平，抑制Bcl-2 mRNA的水平。国内有研究显示HUVECs损伤与JAK/STAT通路的抑制有关，并且提高JAK/STAT的水平可减少HUVECs损伤[13]。国外也有研究显示高糖会通过抑制JAK2/STAT3的水平引起HUVECs损伤[14]。Hu等[15]的研究也得到了相似的结果。这提示尼古丁可能通过抑制JAK/STAT通路磷酸化的水平促进Caspase-3和Bax并抑制Bcl-2的水平，诱导HUVECs凋亡。

综上所述，尼古丁可能通过下调JAK/STAT通路调节凋亡相关蛋白的表达，抑制HUVECs活力并促进其凋亡。这可能与吸烟引起心脑血管疾病有关，但是关于其具体的影响机制还需要进一步的研究。