心力衰竭患者血浆中环状RNA表达谱差异分析

丁汀，李禹龙，李昊峻，马旭，曾小莉，张宏家

心力衰竭（HF）是多种原因导致的心脏收缩和（或）舒张功能发生障碍，是各种心脏疾病的终末阶段，会对人们的身体健康及生活质量造成极大威胁，所以心力衰竭的诊断及预后判断显得尤为重要[1-3]。环状RNA（circRNA）作为一种内源性非编码RNA，曾被认为是因细胞错误剪接而产生的副产物[4]。但随着高通量测序的发展和算法的不断更新，越来越多研究表明它在多种生命活动[5]以及心血管疾病中[6-8]均发挥着重要的作用。于是，这种结构稳定、进化保守、具有组织和阶段表达特异性的小RNA[9]为HF的新型诊断标志物研究提供了一个新的视角。目前有关心力衰竭患者血浆circRNA表达谱的研究仍较为少见。本研究应用circRNA芯片技术，筛选出在心力衰竭患者血浆与疾病对照者血浆中呈现差异性表达的circRNA ，为进一步研究circRNA在心力衰竭发生发展中的作用提供方向。

1 资料与方法

1.1 研究人群收集2017年5月～6月于首都医科大学附属北京安贞医院心内科住院确诊为心力衰竭的患者3例，其中男性2例，女性1例，年龄44～57岁，平均年龄49岁；疾病对照3例，其中男性2例，女性1例，年龄45～65岁，平均年龄56岁，见表1。本研究经首都医科大学附属北京安贞医院伦理委员会批准。所有入组患者知晓并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准HF组的纳入标准：①有心力衰竭的症状和（或）体征；②心脏超声提示左心室射血分数＜45%；③脑钠肽（BNP）＞35 ng/L和（或）N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）＞125 ng。疾病对照组纳入标准：①性别、年龄、慢性基础疾病与HF组患者相匹配的住院患者；②心脏超声及冠状动脉（冠脉）造影结果均无明显异常，无心脏基础疾病。排除标准：①心肌炎、原发性心脏瓣膜病、持续快速室上性心律失常、心包疾病、先天性心脏病、肺源性心脏病、继发于其它全身疾病所致的心脏病变；②全身性慢性消耗性疾病（癌症、肺结核、艾滋病）或多器官衰竭。

表1 研究对象基本信息

1.3 研究方法

1.3.1 提取血浆总RNA根据实际说明使用TRIzol LS试剂盒（Invitrogen公司，美国），提取3例心力衰竭患者和3例疾病对照者血浆中的总RNA，运用NanoDrop ND-1000（Thermo Fisher Scientific，美国）测定所提取的RNA在260、280、230 nm处的吸光度值。

1.3.2 circRNA芯片检测合成cDNA及荧光标记：采用RNase R（Epicentre公司，美国）去除线性RNA，通过Super RNA Labeling（Arraystar公司，美国）方法完成RNA的cDNA扩增及荧光标记。芯片杂交: 将处理好的样本与Human circRNA Array V2（8×15K）芯片（Arraystar公司，美国）进行杂交，之后用清洗液试剂盒（Agilent公司，美国）清洗。circRNA芯片检测、图像收集以及数据分析等工作由上海康成生物公司完成。

1.4 统计学方法Cy3荧光强度的测定通过G2505C基因芯片扫描仪（Agilent公司，美国）进行，数据分析由Agilent Feature Extraction software（version 11.0.1.1）完成，运用R软件包进行数据归一化处理。根据心力衰竭患者样本和疾病对照样本间circRNA的变化倍数（Fold Change，FC）＞1.2，以独立样本t检验P＜0.05为标准进行差异circRNA的筛选。对筛选出的circRNA 作进一步层次聚类分析，并进行散点图和火山图的绘制。运用TargetSca[10]和miRanda[11]两个软件预测最可能与这些差异表达的circRNA结合的miRNA，最后选择其中匹配值最高的5个miRNA进行结合位点的预测和注释。

2 结果

2.1 研究对象基本信息研究对象基本信息见表1。

2.2 RNA样本质量分析6份血浆样本提取的总RNA的D（260 nm）/D（280 nm）比值大于1.8且小于2.0，D（260 nm）/D（280 nm）比值则大于1.8。表明RNA可用于下一步实验分析。

2.3 原始样本circRNA表达情况通过数据的归一化处理后，原始样本中circRNA表达分布情况可以通过盒型图进行展示，结果显示6份样本中circRNA 表达分布几乎是相同的（图1）。

图1 心力衰竭患者血浆（F1-F3）与疾病对照（C1-C3）中circRNA表达情况

2.4 层次聚类分析根据各组标本中circRNA的表达量差异进行监督性层次聚类分析。相对表达较高的circRNA由红色表示，较低的通过绿色表示，这些差异表达的circRNA能将心力衰竭患者与疾病对照患者区分开来（图2）。

图2 心力衰竭患者血浆（F1-F3）与疾病对照（C1-C3）差异表达的circRNA层次聚类分析

2.5 差异表达的circRNA图形分析绘制差异表达circRNA的散点图和火山图。散点图反映心力衰竭患者血浆和疾病对照者血浆circRNA总体分布集中趋势，其中位于line1以上和line3以下的是FC＞1.2且P＜0.05的circRNA（图3）。火山图能够筛选出差异性表达circRNA，其中红色区域表示的是FC＞1.2且P＜0.05的circRNA（图4）。

图2 心力衰竭患者血浆与疾病对照差异表达的circRNA绘制的散点图

图4 心力衰竭患者血浆与疾病对照差异表达的circRNA绘制的火山图

2.6 差异表达的circRNA比较心力衰竭患者血浆及疾病对照血浆中circRNA，筛选出差异表达的circRNA共287种（FC＞1.2，P＜0.05），其中表达上调的有109种，下调的有178种。根据变化倍数和P值进行排序的高表达和低表达的前10名circRNAs见表2～3。对前10名的circRNAs的miRNA结合位点进行预测，匹配值较高的5个miRNAs见表4。

表2 心力衰竭患者血浆中表达上调排名前10的circRNA

表3 心力衰竭患者血浆中表达下调排名前10的circRNA

3 讨论

心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段，我国目前约有心力衰竭患者400万，患病率为0.9%[12]。而世界范围内心力衰竭患者人数也呈现不断上升的趋势[2,3]，心力衰竭对居民身心健康及生活质量的危害日益显现，所以越来越受到临床及科研工作者的关注。心力衰竭的症状和体征往往是非特异性的，而且通常出现较晚，所以没办法及时和准确地反映患者心脏的功能状态。因此，选择敏感可靠的实验室心力衰竭检测指标，对于心力衰竭的早期诊断、及时治疗和改善预后非常重要。传统的心力衰竭诊断标志物BNP与NT-proBNP在心力衰竭诊疗中的价值已为国内外公认[1-3]。但BNP和NT-proBNP的检测也存在局限性，其水平与性别、年龄、BMI等因素有关，肾功能不全、脑梗塞、肺动脉高压等患者可伴有不同程度的升高，此外β受体阻滞剂、脑啡肽酶抑制剂、重组人BNP等药物因素也会对其检测产生一定的影响，故仍需不断寻找其他的心力衰竭检测指标。

circRNA是通过外显子跳跃或者反向剪接等方式产生的共价环状RNA，多由外显子构成，主要存在于细胞质中。在作为新型诊断标志物和治疗靶点上具有极大的潜力[13,14]。circRNA不仅能在细胞内稳定存在，在血清、血浆等细胞外环境中也能长时间保持稳定，这便为circRNA的实验室检测提供了保障[15]。有研究表明circRNA在多种生命活动[5]包括心血管疾病中存在着异常表达的情况，这种异常的表达主要表现为上调、下调或缺失，且与心血管疾病的发生发展相关，提示在心血管疾病的发生发展过程中circRNA可能发挥了十分重要的作用[6-8]。近年来，随着高通量测序技术的不断成熟，目前已有众多研究者对心脏组织[16,17]和外周血液样本[18]中circRNA的表达谱，以及circRNA在心脏发育和心血管疾病发生发展中的作用有了初步的探索。Wang[19]、Du[20]、Werfel[16]等多个团队也都先后报道了可能与心力衰竭相关的circRNA。本研究采用高通量circRNA芯片分析心力衰竭患者血浆和疾病对照血浆的circRNA表达差异。结果显示，共有171种circRNA在心力衰竭患者和疾病对照者血浆中的表达存在差异，其中表达上调的有109种，下调的有178种，提示这些差异表达的circRNA可能与心力衰竭的发生发展相关。

表4 心力衰竭患者血浆中上调及下调的前10名circRNA的miRNA结合位点

研究发现circRNA能够作为miRNA海绵，通过与其结合或者降低其活性，来阻碍miRNA正常生物学功能，从而在疾病的发生发展中发挥其作用[21,22]。本研究预测了与上述差异表达的circRNA结合匹配值较高的5个miRNA。初步分析发现，这些差异表达的circRNA具有miR-194[23,24]、miR-204[25,26]、 miR-211[27]、 miR-16[28,29]、miR-23[30,28,31]、miR-30[28,32,33]、miR-541[34]等在心力衰竭发生发展中发挥重要调控作用的miRNA的结合位点。但这些circRNA能否作为miRNA海绵在心力衰竭的发生发展中发挥作用还需要进一步的研究证实。

本研究是小样本筛选研究，有一定局限性，还需要临床大样本实验及深入的分子机制研究加以验证，进一步探究目标circRNA在心力衰竭发生发展中的作用及其机制，为其诊断以及靶向治疗提供新的方向。