Xpert MTB/RIF检测技术对肺结核的诊断价值

熊梦园，方芳，李一荣

武汉大学中南医院检验科，湖北 武汉 430071

结核病 (tuberculosis) 是由结核分枝杆菌 (M.tuberculosis) 引起的慢性传染病，可侵犯人体全身多种器官，但其主要侵犯肺脏，引起肺结核 (pulmonary tuberculosis，PTB) ，常以乏力、咳嗽、咯血、低热、盗汗等为主要临床表现[1]。据报道，全球约有20 亿结核感染者，且感染人数仍在逐年增长。2017年全球新发结核患者数超过1 000万，其中男性580万、女性320万、儿童100 万，大约9%发生在艾滋病病毒 (HIV) 感染者中。当结核病被及早发现并得到有效治疗时，基本上是可以治愈的。然而，2017 年全球共有约160 万人死于结核病，其中包括30 万HIV 患者[2]。目前我国是全球结核病高负担国家之一，每年新发结核患者数约130万，所面临的结核防控形势十分严峻[3]。鉴于结核病的高患病率、高死亡率及其传染性，早期、快速、准确的诊断是预防和治疗结核病的一项重要因素。Xpert MTB/RIF 检测技术是由美国Cepheid 公司研发的一种结核杆菌快速检测技术，可集样本前处理、DNA自动提取和实时荧光定量PCR (RT-PCR) 于一体，不仅能明确样本中是否存在结核分枝杆菌的DNA，而且能明确其是否对利福平耐药[4]。Xpert MTB/RIF 检测操作简单，仅需少量步骤的准备工作，2 h 内能同时报告结核分枝杆菌及利福平耐药性，相比于涂片镜检 (1 d) 、固体培养 (30 d) 、液体培养 (16 d) 等传统方法大幅度缩短了启动治疗的时间[5]。世界卫生组织 (WHO) 于2010年正式推荐Xpert MTB/RIF用于成人肺结核的诊断，并于2013年推荐其用于诊断儿童肺结核和特定形式的肺外结核[6]。本研究以临床最终诊断结果为金标准，并与涂片抗酸染色镜检及γ-干扰素释放试验 (IGRA) 进行比较，评价Xpert MTB/RIF对肺结核的诊断价值，以期为此技术在我国的进一步推广应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年9 月至2019 年7 月于武汉大学中南医院因疑似肺结核就诊的765例患者作为研究对象，其中男性506例，女性259例，年龄12～100 岁，平均 (56.98±17.37) 岁。共收集到428 份痰液、263 份肺泡灌洗液及74 份胸水，分别进行涂片抗酸染色和Xpert MTB/RIF 检测，同时采集到237 例患者的静脉血，用于进行γ-干扰素释放试验。

1.2 检测方法

1.2.1 涂片抗酸染色与镜检 痰标本的涂片抗酸染色与镜检依据《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》进行[7]。肺泡灌洗液及胸水在涂片前先离心富集，弃去上清液，吸取底部液体涂片，其余步骤与痰涂片镜检相同。

1.2.2 Xpert MTB/RIF检测 765例患者的痰、肺泡灌洗液及胸水标本在进行Xpert MTB/RIF检测前，按以下方式进行预处理：对于痰标本，取1 mL痰标本加入2 mL样本处理液，涡旋震荡10 s，室温放置10 min，重复震荡步骤，室温放置5 min后，取2 mL经过处理的标本加入Xpert MTB/RIF试剂盒，上机检测；对于肺泡灌洗液及胸水，首先3 000 r/min 离心10 min，吸弃上清，加入2 mL 样本处理液，涡旋震荡10 s，充分混匀后加入Xpert MTB/RIF试剂盒，上机检测。

1.2.3 γ-干扰素释放试验 (IGRA) 采用静脉穿刺术采集3 mL全血样本，分装到阴性对照 (N) 、阳性对照 (P) 和检测 (T) 三种含有刺激抗原的培养管中，每管1 mL。检测试剂盒来自海口维瑅生物研究院，实验步骤依据说明书进行。分别读取N、P、T 反应的OD 值，计算出T-N、P-N和 (T-N) / (P-N) 的值，当N＜0.5时，T-N/P-N≥0.16将结果判定为阳性，T-N/P-N＜0.16则将结果判定为阴性；当0.5≤N＜2.5 时，T-N≥1.5 将结果判定为阳性，T-N＜1.5 则将结果判定为阴性；当N≥2.5 时，判为无法确定。

1.3 统计学方法 采用IBM SPSS25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t 检验，计数资料的比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。判断各检验方法与临床诊断结果的一致性采用Kappa检验，K＜0.4为一致性差，0.40≤K＜0.75 表示一致性较好，K≥0.75 为一致性极好。

2 结果

2.1 一般资料 以临床诊断为金标准，765 例疑似肺结核病患者中，共有195例最终确诊为肺结核，其中男性136 例，女性59 例；平均 (58.75±16.84) 岁；原发性肺结核60 例，血行播散性肺结核3 例，继发性肺结核87 例，气管、支气管结核13 例及结核性胸膜炎32例，同时有31 例患者伴有HIV 感染。570 例患者排除结核感染，其中男性370 例，女性200 例；平均 (57.43±17.33) 岁；肺炎226例，支气管扩张伴感染136例，肺癌62 例，慢性阻塞性肺疾病36 例及其他感染110 例，其中55 例患者同时合并HIV 感染。两组患者性别与年龄比较差异均无统计学意义 (P＞0.05) 。

2.2 Xpert MTB/RIF 与涂片镜检检测结果 以临床诊断结果为金标准，Xpert MTB/RIF 与涂片抗酸染色镜检检测的阳性检出率、对肺结核诊断的灵敏度、特异性、阳性预测值 (PPV) 、阴性预测值 (NPV) 、准确度及与临床检验诊断结果的一致性见表1。χ2检验表明，Xpert MTB/RIF 对肺结核的阳性检出率、灵敏度、准确度及阴性预测值明显高于涂片抗酸染色镜检，差异有统计学意义 (P＜0.05) 。Kappa检验结果表明，对于与临床诊断结果的一致性，Xpert MTB/RIF 检测优于涂片镜检，K 值分别为0.628和0.173。另外，Xpert MTB/RIF 同时可测得利福平耐药性检出率为6.25% (7/112) 。

表1 Xpert MTB/RIF与涂片镜检的检测结果比较[% (比值) ]

2.3 IGRA 检测与Xpert MTB/RIF 联合IGRA 检测结果比较 本研究中有237例患者在行Xpert MTB/RIF检测的同时进行了IGRA检测，两者任一结果为阳性则判定为联合检测结果阳性。根据临床诊断结果，79 例确诊为肺结核，其中男性57 例，女性22 例；平均 (56.76±17.46) 岁。158例排除肺结核，其中男性113例，女性45例；平均 (55.52±18.63) 岁。两组患者性别与年龄比较差异均无统计学意义 (P＞0.05) 。IGRA 及Xpert MTB/RIF检测结果见表2，两者的灵敏度及特异度比较差异均无统计学意义 (P＞0.05) 。但与单独IGRA检测和单独Xpert MTB/RIF检测相比，两者联合检测的灵敏度显著提高，特异度有所下降 (P＜0.05) 。两者与临床诊断结果的一致性相似，K值分别为0.529和0.546，两者联合检测一致性略有提高，K值为0.692。

表2 IGRA检测与及Xpert MTB/RIF联合IGRA检测结果比较[% (比值) ]

2.4 合并感染HIV者Xpert MTB/RIF与IGRA检测结果比较 本研究共纳入86 例HIV 患者，其中31例确诊同时感染肺结核，对于此类患者，Xpert MTB/RIF 对肺结核诊断的灵敏度、特异度、PPV、NPV 分别为41.94% (13/31) 、100.00% (55/55) 、100.00% (13/13) 、75.34% (55/73) 。IGRA 对肺结核诊断的灵敏度、特异度、PPV、NPV 分别为45.16% (14/31) 、92.73% (51/55) 、77.78% (14/18) 、75.00% (51/68) 。 HIV 组 中Xpert MTB/RIF检测与IGRA的灵敏度、特异度、PPV及NPV比较差异均无统计学意义 (P＞0.05) 。

2.5 Xpert MTB/RIF对不同类型的标本检测结果比较 按标本类型分类，可将标本分为痰组、肺泡灌洗液组及胸水组，各组Xpert MTB/RIF检测结果如表3所示。χ2检验表明，三组不同类型的标本阳性检出率、灵敏度、阴性预测值及准确度差异均有统计学意义 (P＜0.05) ，痰组与肺泡灌洗液组阳性检出率灵敏度、阴性预测值及准确度比较差异均无统计学意义 (P＞0.05) ，但均与胸水组差异有统计学意义 (P＜0.05) 。痰组、肺泡灌洗液组与临床诊断结果一致性较好，远高于胸水组 (K值分别为0.624、0.728和0.252) 。

表3 不同类型的标本Xpert MTB/RIF检测结果[% (比值) ]

3 讨论

早期快速、准确地诊断肺结核 (包括涂片阴性肺结核和耐药结核) 对于改善患者预后，减少结核病传播、降低结核病死亡率、减轻患者和社会负担等多个方面至关重要，是完成世界卫生组织 (WHO) “终结结核病战略”的战略基础[8]。现有的临床诊断方法中，结核分枝杆菌培养通常被认为是诊断结核病的金标准，并且是检测结核杆菌耐药性的关键步骤。然而，结核杆菌培养是一个相对复杂和缓慢的过程，固体培养通常需要1～2个月的时间才能得到结果，液体培养虽然比固体培养更敏感和快速，但仍需要2个星期以上，而且临床上菌阴结核较为常见；血清学诊断多受抗原纯度和特异性影响。随着近年来现代化科技水平的不断提高，新型分子诊断技术层出不穷，Xpert MTB/RIF检测技术以其操作简便、快速等诸多优点受到广泛关注。

Xpert MTB/RIF 检测技术同时采用6 种分子探针及6种分子信标，选择性的覆盖rpoB基因上81 bp的利福平耐药决定区，检测是否结核杆菌感染及其利福平耐药性。研究表明，rpoB基因突变存在于95%以上的利福平耐药菌株株，因此，可选择rpoB基因作为检测利福平耐药性的相关基因[9-10]。Xpert MTB/RIF检测技术集标本处理、DNA提取、基因实时扩增和荧光检测于一体，操作简单便捷，并且过程中不容易产生气溶胶污染，从而可降低结核杆菌生物危害的风险。独立包装的检测试剂盒也减少了DNA污染的机会，对实验室生物安全和环境要求较低，需要的生物安全防护级别与直接涂片镜检相当，对操作人员要求也较低，可逐步推广用于POCT检测[11]及我国基层医院[12]。

本研究中，共有195 例患者确诊为肺结核，占25.49%，Xpert MTB/RIF 检测技术阳性检出率为14.64%、诊断灵敏度、NPV 和准确度分别为54.87%、86.52%和87.84%，均显著高于涂片抗酸染色镜检，其与临床诊断结果一致性也远高于涂片镜检，Xpert MTB/RIF 检测技术特异度、PPV 大于95%，说明临床上开展Xpert MTB/RIF检测，可帮助临床实现快速、较准确的诊断，减少漏诊和误诊。但与其他研究[13]相比，本研究中Xpert MTB/RIF灵敏度、PPV较低，可能与不同地区结核病患病率不同有关。本次研究肺结核患者占比不高，也可能与标本取材、样本前处理等有关。研究表明，痰涂片镜检及Xpert MTB/RIF 的检出性能很大程度上受标本质量的影响[14-15]，临床上患者经常出现少痰、无力咳痰或痰标本不合格的情况，痰液含菌量较少，无法达到检测限。临床医生留痰时应向患者讲解留取痰标本的重要性及如何从肺部深处咳痰，注意不要留取到鼻腔或咽部分泌物等。此外，咯血是肺结核常见临床表现之一，痰液中的红细胞可以抑制PCR反应，对于此种标本，应进行预先处理，尽可能去除痰中混有的红细胞。Xpert MTB/RIF对不同标本检出效率有所不同，综合分析，肺泡灌洗液检出效能最佳，痰液次之，胸水检出效果不佳，与另一项研究结果[16]相符。痰样本阳性检出受限于病变部位、样本质量等多个因素，肺泡灌洗液则是通过支气管镜直接留取病变部位灌洗液进行检测，并且肺内各叶、段均可使用，扩大了检查范围，结核杆菌载量较高，因此检出阳性率较高。THERON等[17]对南非单中心154例疑似肺结核患者进行了一项前瞻性研究，对采集的肺泡灌洗液行Xpert MTB/RIF 检测，以培养结果为金标准，其灵敏度、特异度分别为92.6%、96.0%，远高于涂片镜检。可见对于需要支气管镜检查的疑似结核病或少痰患者，可同时采集其肺泡灌洗液行Xpert MTB/RIF 检测，检测前对肺泡灌洗液进行离心富集会大大提高其阳性检出率。结核性胸膜炎是结核杆菌直接感染或胸膜对结核杆菌菌体成分产生迟发型变态反应而发生的炎症，归为Ⅴ型肺结核，患者常出现胸腔积液。本研究中，胸水组Xpert MTB/RIF 检测敏感度仅为19.05%，远低于痰组及肺泡灌洗液组，其特异度及阳性预测值均为100.00%，证明该方法对结核性胸膜炎的诊断价值有限。SEHGAL等[18]针对结核性胸膜炎的Meta分析也证明了这一点，其原因可能是胸腔积液中结核杆菌载量较低，难以达到检测限。WHO 不推荐胸水作为病原学证据确诊结核性胸膜炎，应首选胸膜活组织。此外，Xpert MTB/RIF 检测技术仅针对结核杆菌的DNA，无法分辨细菌存活状态，在部分陈旧性肺结核中，也可能检测到结核杆菌DNA。因此，诊断阳性患者还要结合临床及其他相关检查来判断肺结核的活动性。

γ-干扰素释放试验是一项特异性T淋巴细胞免疫检测技术，不受卡介苗接种和大多数非结核分枝杆菌的干扰，已被广泛应用于临床，辅助诊断结核感染[19]。相比于单独检测，Xpert MTB/RIF及IGRA联合检测的灵敏度明显提高。肺结核是HIV 患者最常见的机会性感染之一，对于此类患者，早期诊断尤为重要。本研究中包括86例HIV患者，确诊为肺结核的有31例，但Xpert MTB/RIF检测对其诊断价值有限，且与IGRA检测差异无统计学意义，可能原因是样本量太小，不具有广泛的代表性，也可能是HIV患者免疫功能降低干扰检测效能。研究表明，大约90%的耐利福平结核杆菌也可能对异烟肼耐药，因此检测结核杆菌对利福平的耐药性一定程度上也可作为检测多重耐药结核分枝杆菌的一种手段[20-21]，为临床医生选择治疗方案提供诊断依据。本研究有一些局限性。本研究是一项单中心的回顾性分析，样本量不足，部分信息缺失，并且未讨论结核性脑膜炎、骨结核、淋巴结结核等肺外结核。有研究表明，Xpert MTB/RIF 检测技术对肺外结核有一定的诊断价值[22-23]，对于此类结核，选择合适的标本进行检测十分重要。

综上所述，Xpert MTB/RIF检测具有高灵敏度、高特异度、易于操作、交叉污染少、可快速检测利福平耐药性等优点，能为肺结核的早期诊断及治疗方案的选择提供有效依据，具有广阔的应用前景，值得临床推广使用。