A型肉毒毒素对增生性瘢痕组织中bFGF、caspase-3和Bcl-2表达的影响

武凤莲 朱东来 王连英 王嘉欣

瘢痕是各种创伤引起的正常皮肤组织的病理变化，是人类创面愈合过程中的必然结果[1]，当创面过度修复时，成纤维细胞大量增生以及胶原基质的过度沉积，可发生纤维增生性真皮损伤，并发展成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩[2]。瘢痕疙瘩是结缔组织异常愈合的一种形式，其特征是过度增殖和透明变性[2]。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的病因尚不清楚，治疗仍是临床上的一个挑战。目前的治疗方法包括外科和非手术方法，如压迫、硅胶片、冷冻疗法、激光、病灶内注射类固醇、5-Fu和A型肉毒杆菌毒素(BTXA)[3,4]。瘢痕病灶内注射BTXA是目前比较有前途的预防和治疗增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的方法之一。但直到现在其预防及治疗瘢痕的具体机制原理尚不十分清楚[5]。本研究旨在通过A型肉毒毒素对瘢痕中bFGF、caspase-3及 Bcl-2表达的影响，进一步探讨其治疗增生瘢痕的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司 USA)；BTXA(兰州生物制品研究所)；Trizol 总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒(美国 PROMEGA公司)，胰蛋白酶购于德国Merk公司；MTT、DMSO、AO/EtBr荧光剂购于SIGMA USA;BCA试剂盒(BD Parmingen 公司)；bFGF抗体、caspase-3抗体及Bcl-2抗体(CTS,英国)；光学显微镜，荧光显微镜，PCR 仪器，凝胶图像分析系统。

1.2 实验标本 实验所用标本全部来源于2016至2018年秦皇岛市第一医院整形烧伤外科的门诊及住院瘢痕患者。瘢痕部位包括面部、上肢，胸背部，患者近期并没有接受激光、放射线及其他药物治疗，病程最短为3个月，最长为4年。取标本前均得到患者的知情同意。

1.3 增生性瘢痕成纤维细胞培养 将取下的手术标本按无菌操作程序用配好的抗生素生理盐水进行反复冲洗3次后，剪去多余皮下组织后，将只保留带表皮的瘢痕组织剪成所需大小的小组织块，用PBS缓冲液反复冲洗干净后接种于含有培养液的培养方瓶中，在特定条件的孵箱中进行瘢痕成纤维细胞原代的培养，根据原代成纤维细胞的生长情况进行更换培养瓶中的培养液，一般1周更换2～3次。待原代成纤维细胞爬满瓶底即可进行传代培养，原代细胞从组织块中爬出到铺满培养瓶底一般需要3周左右的时间。本实验所用细胞为3～6代。

1.4 实验分组 将实验分为5组：对照组(培养液中不加任何干扰因素)，培养液中加入A型肉毒毒素，浓度分别为0.2～1.6 U/ml。 取对数生长期的细胞，接种于6孔板中，没孔加入2 ml培养液，待细胞贴壁后，更换无血清培养基饥饿培养24 h后，使细胞同步于G0期后，更换含10%小牛血清的DMEM，同时加入各组药物培养24 h。

1.5 成纤维细胞增殖活力的测定 取对数生长期的瘢痕成纤维细胞,用胰酶消化后调制成为1×106/ml成纤维细胞悬浮液，96孔培养板中每孔接种200 μl的成纤维细胞。置于5% CO2，37℃培养箱培养约24至细胞长至单层。待细胞完全贴壁后去除培养液，用PBS洗1～2遍，加入用含血清的培养基稀释得到各组BTXA浓度的药液。每个药物浓度组0.2～1.6 U/ml及对照组设6个复孔，每孔加 150 μl药液,将细胞培养板分别置于培养箱中孵育24 h、48 h后弃上清，用PBS缓冲液溶液洗2遍，后每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl 继续孵育3 h后，弃掉上清液，每孔加200 μl DMSO振荡混匀，沉淀溶解完全后用自动酶标比色仪在波长 490 nm 处读取吸光值(A490)时测定其OD值。计算药物的抑制率 (IR)。IR=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%

1.6 吖啶橙和溴化乙锭(AO/EtBr)双重染色 采用荧光染料吖啶橙和溴化乙锭(AO/EtBr)双重染色技术检测A型肉毒毒素对增生性瘢痕成纤维细胞形态的影响。用胰蛋白酶消化后将成纤维细胞制成1×106悬浮液接种于96孔培养板中，用浓度为0.4 U/ml,0.8 U/mlBTXA处理组细胞置于5% CO2，37℃培养箱培养约24 h后，收集细胞，PBS 洗涤2次，加入10 μl的吖啶橙和溴化乙锭染料，10 min后继续置于37.0℃、5%(体积分数)的CO2饱和度的孵箱中继续孵育15 min， 然后用荧光显微镜检查并摄像捕获图像，并用Image J软件评估。

1.7 RT-PCR 总RNA是从增生性瘢痕成纤维细胞中分离出来，将含有不同浓度(0.2、0.4、0.8、1.6 U/ml)BXTA及对照组的培养液加入对数生长的密度为1×106个/ml的成纤维细胞混悬液中，将细胞放置于孵育箱中培养24h，弃上清液收集细胞。按总RNA抽提试剂盒说明书，操作步骤按试剂盒的操作指南进行。采用 Trizol 法提取总 RNA，经NanoDrop ND-2000 紫外分光光度仪检测完整性后于-80℃保存备用。对所有样品取2 μg总RNA ，利用Promega公司的逆转录试剂盒的操作步骤进行合成 cDNA。2 μl cDNA与2 μl 引物混合，于25 μl反应体系进行扩增。将各组样本扩增后的10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶扫描成像分析仪处理系统扫描各条带紫外光吸收量(Vol)。以为β-actin内参，检测各组bFGF、caspase-3及Bcl-2基因的Vol与内参β-actin的Vol的比值作为其mRNA的相对表达量，并比较对照组与加入不同浓度肉毒毒素作用后增生性瘢痕成纤维细胞bFGF、caspase-3及Bcl-2表达的变化,每组重复实验3次。见表1。

表1 用primer5.0辅助设计引物

1.8 Western blotting 用Western blotting检测各组细胞中bFGF、caspase-3及Bcl-2蛋白的表达量。用胰蛋白酶消化对数生长期的3～6代瘢痕成纤维细胞并制成1×106个/ml细胞悬液，并接种于96孔的培养板上，每孔分别接种100 μl的成纤维细胞混悬液。把接种细胞的培养板放于37.0℃、5%(体积分数)的CO2饱和湿度中常规培养24 h后弃上清液，用10%小牛血清的DMEM配制含BTX的细胞培养液，BTXA浓度为0.2～1.6 U/ml,培养液每组设6个平行孔及空白对照孔，各组加入配好的药液200 μl后继续孵育24 h后，收获细胞，并用含有蛋白酶抑制的裂解缓冲液对细胞进行裂解，于4℃,10 000 r/min离心10 min，取得蛋白样品。BCA法测定各组蛋白浓度，每个处理过的样品用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移PVDF膜(Millipore,Bedford,UK)。10%脱脂奶粉封闭2 h后，用一抗在4℃下孵育过夜，然后室温下用二抗孵育1 h，最后把所得样品置于凝胶成像系统曝光。并用Image软件分析各样品与对照蛋白灰度比值作为目标基因蛋白的相对含量。

2 结果

2.1 A型肉毒毒素对细胞增殖的抑制作用 对数生长期的增生性瘢痕成纤维细胞在A型肉毒毒素的作用下其增殖速度减慢，同一作用时间里，中、高浓度的BTXA作用下的成纤维细胞的增殖抑制更加明显；且同一药物浓度作用后，作用时间的延长，成纤维细胞的抑制率也越高(P<0.05)。见表2。

BTXA浓度(U/ml)抑制率24 h48 h0(对照)0∗0∗0.25.51±0.7258.93±0.01020.49.16±0.09312.35±0.02560.823.67±0.03435.05±0.02311.674.01±0.07883.48±0.0257

注：与各浓度组比较,*P<0.01

2.2 A型肉毒毒素对增生性瘢痕成纤维细胞形态的影响 早期凋亡细胞用吖啶橙染色为黄绿色，凋亡晚期细胞用溴化乙锭染色为橙色。与对照增生性瘢痕成纤维细胞相比，A型肉毒毒素处理的瘢痕成纤维细胞显示出更多的黄绿色和橙色染色的细胞，说明成纤维细胞开始出现凋亡。与对照组比较，0.4 U/ml肉毒毒素处理的成纤维细胞显示出更多的黄绿色，在0.8 U/ml肉毒毒素处理细胞中观察到溴化乙锭橙色染色的晚期凋亡细胞数量明显增加，说明随着肉毒毒素浓度的增加，成纤维细胞的凋亡的数量也增加。见图1。

对照组0.4 U/min0.8 U/ml

图1A型肉毒毒素对增生性瘢痕成纤维细胞形态的影响

2.3 BTXA对5组细胞中bFGF、caspase-3及Bcl-2mRNA表达的影响 与对照组比较，对用含有0.2、0.4、0.8、1.6 U/ml浓度的A型肉毒毒素的培养液孵育24 h的成纤维细胞进行RT-PCR结果显示bFGF及Bcl-2的mRNA表达量下降，中、高浓度组明显下降(P<0.05)；caspase-3的mRNA表达呈升高趋势，高浓度组尤为明显(P<0.05)。见图2。

图2BTXA对增生性瘢痕成纤维细胞bFGF、caspase-3及Bcl-2mRNA的影响

2.4 BTXA对5组细胞中bFGF、caspase-3及Bcl-2蛋白表达量的影响 Western blotting 结果显示，与空白对照组比较，含有0.2、0.4、0.8、1.6 U/ml浓度的A型肉毒毒素的培养液培养24 h的增生性瘢痕成纤维细胞内，bFGF及Bcl-2的蛋白表达量下降，中、高浓度组明显下降(P<0.01)；caspase-3的蛋白表达量呈升高趋势，高浓组尤为明显(P<0.01)。见表3，图3。

BTXA(U/ml)bFGFcaspase-3Bcl-201110.20.91±0.12∗1.53±0.80∗0.89±0.03∗0.40.79±0.03∗1.89±0.47∗0.76±0.32∗0.80.65±0.24∗#2.32±0.11∗#0.63±0.53∗#1.60.49±0.1∗#2.91±0.26∗#0.56±0.31∗#

注：与0比较,*P<0.05；与0.2、0.4比较，#P<0.01

图3不同浓度BTXA(U/ml)干预后增生性瘢痕成纤维细胞bFGF、caspase-3及Bcl-2蛋白的表达

3 讨论

伤口愈合治疗仍然是一个巨大的临床挑战[6]，因为伤口愈合是一个非常动态、复杂和相互作用的过程，包括典型的炎症阶段、细胞增殖期阶段和细胞外基质重塑期三个重叠的阶段[7,8]。在皮肤创伤修复的过程当中，病理学上会出现异常的表现，即在愈合过程中成纤维细胞会出现过度增殖，一些相关蛋白，包括胶原蛋白、纤联蛋白还有氨基多糖等细胞外基质会出现过度沉积，进而导致皮肤创伤后过度修复而形成增生性瘢痕。成纤维细胞是胶原母细胞，分泌胶原，在瘢痕形成中，成纤维细胞不能够进入正常的凋亡程序，而出现异常的过度增殖，进而导致胶原的过度分泌沉积，故成纤维细胞的异常增殖在增生性瘢痕的形成和发展中起着至关重要作用[9]。目前很多研究都在尝试用药物治疗瘢痕，通过药物的诱导能够使成纤维细胞进入正常凋亡程序，这是预防及治疗增生性瘢痕的一个很有意义的研究方向。有多篇报道显示A型肉毒毒素改善了增生性瘢痕的症状[10-12]。肉毒毒素是一种由革兰氏阳性肉毒梭菌中提取的一种强效神经毒素，存在于多种血清型(a型至G型)中。二十多年来，应用A型肉毒毒素治疗各种疾病，包括眼睑痉挛和面部功能亢进，已被证明是安全有效的[13-15]，所以多年来，它在各种医疗条件的治疗中的应用在医学和美学上都得到了扩展。目前A型肉毒毒素的作用机制已被证明包括对伤口张力的作用、对胶原的作用和对成纤维细胞的作用。然而，A型肉毒毒素治疗瘢痕的的具体分子机制尚不清楚，仍然在探索中。

本研究中，A型肉毒毒素(浓度为0.2～1.6 U/ml)作用于体外增生性瘢痕的成纤维细胞，通过MTT法检测A型肉毒毒素对成纤维细胞有明显抑制作用,荧光染料吖啶橙和溴化乙锭(AO/EtBr)双重染色技术检测A型肉毒毒素可以诱导瘢痕成纤维细胞的凋亡，并且呈浓度剂量依赖趋势；用半定量RT-PCR测定中、高浓度的A型肉毒毒素做用的成纤维细胞中bFGF及Bcl-2的mRNA表达量明显下降，caspase-3的mRNA表达呈升高趋势；用Western blotting检测各组细胞发现bFGF、Bcl-2蛋白的表达量呈下降趋势，caspase-3的蛋白表达量升高。我们知道bFGF是一种作用广泛的细胞因子，它在创面愈合过程中的基本生物学作用是所有相关细胞的促有丝分裂原、化学趋化及调节蛋白[16]。有人在研究细胞周期的分析过程中发现，细胞在生长、增殖、分化及凋亡的各细胞周期转换中，bFGF可以诱导并促进细胞从G0、G1期进入S期，从而使成纤维细胞、上皮细胞和血管内皮细胞的快速增殖与分化[17]。本实验中发现随着A型肉毒毒素浓度的增加，bFGF的表达呈下降趋势，说明bFGF表达的降低可能使细胞在周期转换中停滞在G1期导致细胞DNA复制和有丝分裂产生障碍，进而加速细胞凋亡。caspase-3为半光氨酸天门冬氨酸蛋白酶的简称，它在细胞凋亡过程中处于很重要的位置，是细胞毒性T淋巴细胞杀伤机制的重要组成部分[18]。caspase-3是caspase家族成员中最重要的效应因子，处于凋亡有序级联反应的下游，是多种凋亡信号通路的最终汇集点，大多数触发细胞的因素，最终都需要通过caspase-3介导信号传导途径而致细胞凋亡，是凋亡的主要执行者[19]。细胞可以进入正常程序性凋亡的过程中，Bcl-2家族成员扮演着至关重要的角色，其中非常重要的成员抗凋亡和促进凋亡两类蛋白质同属于Bcl-2家族。

Bcl-2能够通过抑制caspase-3、-7过度表达所诱导的凋亡，说明Bcl-2可能对下游caspase有抑制作用，参与对caspase活性的调节，但Bcl-2家族某些成员能被caspase-3所剪切，产生具有促凋亡作用的片段，导致多种细胞凋亡[20]。本实验中随着A型肉毒毒素浓度升高，细胞中的caspase-3表达升高，Bcl-2的表达下降。因此，两者的负相关的表达加速了瘢痕成纤维细胞的凋亡。

本实验中A型肉毒毒素能够下调bFGF和Bcl-2蛋白的表达，上调caspase-3的表达，这可能是A型肉毒毒素抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖并诱导成纤维细胞凋亡，治疗增生性瘢痕的重要机制，为A型肉毒毒素治疗增生瘢痕提供更多理论基础。