阿替普酶对脑梗死大鼠的疗效观察及对血清中GAP-43、NGF、MDA水平的影响

于海燕 王东玉 闵连秋

脑梗死发病的主要原因是脑部因血液供应不足，缺血缺氧导致脑组织出现坏死和软化，主要发病是老年人，数据显示，脑梗死患者年龄有年轻化趋势，严重威胁者人们的身体健康[1]。阿替普酶是一种血栓溶解药物，赖氨酸残基与纤维蛋白结合，并激活与纤维蛋白结合的纤溶酶原转变为纤溶酶，在治疗心肌梗死上具有显著效果[2]。血清中生长相关蛋白-43(GAP-43)参与神经发育以及轴突再生,与神经生长因子(NGF)在神经功能中发挥着重要的作用[3,4]。本文主要研究阿替普酶对脑梗死大鼠的疗效观察及对血清中GAP-43、NGF、丙二醛(MDA)水平的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 选择SD健康雌性大鼠30只，由锦州医科大学实验动物中心提供。年龄6～10周龄，平均(8.0±1.8)周；体重120～280 g,平均(240.3±120.1)g，饲养温度22～25℃，室内湿度35%～37%，饲养室定时进行紫外线照射消毒。统一喂给标准饲料，允许它们自由活动，饲养时间为1周。

1.2 方法

1.2.1 脑梗死模型建立：选取20只大鼠进行脑梗死模型制备，给予10%的水合氯醛麻醉，把大鼠仰卧固定在实验台上，充分暴露其颈部皮肤，用75%的乙醇消毒后，打开大鼠颈部皮肤，利用分离针分离出颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，在远心端结扎颈外动脉，然后在颈内动脉远心端和颈总动脉近心端，用动脉夹阻断循环血流。将颈外动脉在结扎处剪断，从剪断处插入栓线，直至颈内动脉处，然后打开颈内动脉夹，继续推进栓线，直到遇到阻力，当阻断大脑中动脉血流后，继续将栓线深插入18～20 mm，最后固定栓线并缝合皮肤。2 h后再次10%的水合氯醛麻醉大鼠，把栓线拔出来，缝合伤口，75%乙醇消毒。模型制备完成以后，给予大鼠抗感染感染护理，让其自由摄食和饮水。大鼠苏醒后，左侧表现为Horner征，提尾时右侧前肢内收屈曲,右前爪不能伸展或存在右侧转圈障碍，则建模成功。手术过程中，死亡2只，感染1只，另外还有1只建模失败，建模成功共16只。

1.2.2 分组及用药：将建模成功的16只大鼠随机分为模型组和阿替普酶组，每组8只，正常组大鼠10只。阿替普酶组大鼠静脉注射阿替普酶，5 mg/kg；正常组和模型组大鼠注射等体积的无菌0.9%氯化钠溶液，连续治疗7 d。

1.2.3 脑梗死体积TTC染色：所有大鼠进行抽取股动脉血后，处死。采用0.9%氯化钠溶液对其血液进行冲洗，将脑组织取出后，在-20℃速冻10 min，在冠状位切取三片，每片厚度为2 mm，将组织切片在2%的TTC溶液中进行染色，注意要避光，37℃进行孵育30 min，在这一过程中要对玻片进行翻动，染色均匀，取出后在10%多聚甲醛溶液中进行24 h固定，采用Image-J图像进行数据分析。脑梗死体积=(玻片脑梗死面积/玻片总面积)×100%。

1.2.4 脑组织含水量测定：主要采用干湿法进行。将取出的脑组织在天平上进行称重，之后在110℃的干燥箱干燥完全脱水后，再次进行称重，根据公式脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.2.5 大鼠ZeaLonga评分[5]：无神经缺损,大鼠活动正常，为0分；大鼠对侧前肢不能完全伸展，为1分；大鼠行走不稳，身体出现偏瘫并转圈，为2分；大鼠身体出现偏瘫并发送倾倒，为3分；大鼠不能行走，其意识完全消失，为4分，分数越高，说明大鼠神经损伤越严重。

1.2.6 大鼠脑组织病理学：将采集到的标本在10%的甲醛缓冲液中保持48 h，之后脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡处理后，采用HE进行染色，在显微镜下观察大鼠脑组织病理学特征。

1.2.7 ELISA法检测GAP-43、NGF、MDA水平：将抽取的大鼠股动脉血在抗凝管中保存，之后使用转速为1 000 r/min的离心机，离心处理20 min，提取血浆，放入洁净的EP试管中，在-20℃环境中保存，待用。采用50 mmol/L碳酸盐包被缓冲液将标本进行溶解，浓度为10～20 μg/ml，在96孔酶标板中加入100 μl/孔，4℃过夜保存。第2天舍弃包被液，采用PBST洗涤3次，没孔中加入1%的150 μl BSA，在37℃环境中封闭1 h。之后采用PBST洗涤3次，在每孔中加入100 μl不同倍比稀释度的血清，加入对照样品，37℃孵育2 h。采用PBST洗涤5次，加入100 μl,稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗涤5次，之后，使用显色剂显色20 min后，在酶标仪上读取A405吸收值。

1.2.8 Western blot检测PTEN、mTOR、PKA蛋白表达：将采集到的标本，使用PBS缓冲液清洗3遍以上，分离缓冲液，加入IP细胞裂解液，进行裂解35 min，提取总蛋白，BCA测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，通过10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白缓冲液15 min；100 V,电泳10 min，结束之后，将电转膜浸泡在10%的牛奶中，在37℃环境下的摇床上封闭1.5 h；与一抗结合，加入TBST稀释按(1∶1 000)稀释一抗Tubulin(内参照)，在4℃的环境下孵育过夜保存；第2天用TBST缓冲液清洗，与二抗结合在室温下孵育1 h，再次用TBST缓冲液清洗反复清洗。最后加入显影剂将其仅在底物溶液中进行显色，严格按照显影定影试剂盒操作说明书进行。

2 结果

2.1 3组大鼠脑组织病理学观察 正常组在海马区和皮质未发现梗死，与正常的脑组织结构未发现明显的界线；模型组在皮质发现了较大面积的梗死，并且危及海马区，与正常的脑组织结构存在明显的界线，周围与神经相关的细胞数量急剧减少，出现水肿；细胞核发生固缩并且深染，核仁在逐渐消失，出现炎性细胞浸润，细胞浆液疏松。阿替普酶组脑梗死的面积明显减小，胶质细胞增殖，水肿现象显著改善。见图1。

图1 3组大鼠脑组织病理学观察(HE染色×200)

2.2 3组大鼠脑梗死体积、脑组织含水量、ZeaLonga评分比较 3组大鼠脑梗死体积、脑组织含水量、ZeaLonga评分比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠脑梗死体积高于正常组(t=27.23，P=0.00)，脑组织含水量高于正常组(t=8.19，P=0.00),ZeaLonga评分显著高于正常组(t=9.92，P=0.00)，差异有统计学意义(P<0.05)；阿替普酶组大鼠脑梗死体积低于模型组脑组织(t=18.50，P=0.00)，脑组织含水量低于模型组脑组织(t=5.15，P=0.00)，ZeaLonga评分低于模型组(t=2.48，P=0.03)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别脑梗死体积(mm3)脑组织含水量(%)ZeaLonga评分(分)正常组(n=10)0.00±0.0077.45±0.450.00±0.00模型组(n=8)94.92±11.1179.62±0.631.65±0.53阿替普酶组(n=8)56.01±9.6578.28±0.420.96±0.58 F值40.8412.8014.88 P值0.000.000.00

2.3 3组大鼠血清中GAP-43、NGF、MDA水平比较 3组大鼠治疗后血清中GAP-43、NGF、MDA水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组GAP-43水平显著高于正常组(t=3.70，P=0.00)，NGF水平显著高于正常组(t=8.34，P=0.00)，MDA水平显著高于正常组(t=7.35，P=0.00)，差异有统计学意义(P<0.05)；阿替普酶组GAP-43水平低于模型组(t=2.24，P=0.04)，NGF水平低于模型组(t=4.57，P=0.00)，MDA水平低于模型组(t=5.78，P=0.00)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组别GAP-43(ng/L)NGF(ng/ml)MDA(nmol/ml)正常组(n=10)0.93±0.02167.45±12.459.45±1.46模型组(n=8)1.72±0.68119.62±11.6314.65±1.53阿替普酶组(n=8)1.18±0.35148.28±13.4210.96±0.96 F值5.5512.5011.03 P值0.000.000.00

2.4 阿替普酶对脑梗死大鼠作用机制研究 3组大鼠治疗后PTEN、mTOR、PKA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组PTEN表达水平高于正常组(t=7.09，P=0.00)，模型组mTOR表达水平高于正常组(t=3.19，P=0.01)，模型组PKA表达水平高于正常组(t=5.33，P=0.00)，差异有统计学意义(P<0.05)；阿替普酶组PTEN表达水平低于模型组(t=3.28，P=0.01)，mTOR表达水平低于模型组(t=2.21，P=0.04)，PKA表达水平低于模型组(t=3.55，P=0.00)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

组别PTENmTORPKA正常组(n=10)0.23±0.087.45±2.456.55±2.46模型组(n=8)0.97±0.3212.78±4.5413.66±3.21阿替普酶组(n=8)0.56±0.159.05±2.458.79±2.18 F值10.644.869.60 P值0.000.010.00

3 讨论

脑梗死是一种临床上的常见脑血管疾病，其特点是治疗后高复发率、高死亡率和高致残率，极大降低患者的生活质量。相关数据显示，我国近些年，脑梗死的发病率有明显上升的趋势[6]。正常情况下，脑毛细血管与脑细胞之间存在血脑屏障，血脑屏障可以阻止有害物质进入脑组织，进而保护脑组织不受损伤，减少有害物质的侵害[7]。依靠这种方式，保持着脑组织内环境的稳态，这对于生物的生长生存具有重要的价值。脑梗死病发后，血清中炎性因子表达明显升高，氧自由基增多，蛋白水解酶等大量表达，微血管内皮细胞遭到破坏，血脑屏障的通透性增加，一些有害物质会通过血液循环进入脑组织，而脑组织中的一些物质也可进入血液循环，进而加重疾病，特别是在脑神经元再生过程中，这种现象更加严重，严重影响患者的生命安全[8,9]。

阿替普酶属于第三代新型的一种溶栓药物，其特异性以及在半衰期，阿替普酶的溶栓效果表现良好。研究显示，急性脑梗死发病时会释放大量的炎性应激因子，在患者体内相互拮抗，其水平变化导致了局部的血流障碍[10]。阿替普酶可以有效的减少血液的粘稠度，以及凝固性，对血小板的凝聚具有显著的抑制作用，对血管侧支循环阻力有减轻效果，改善血液的微循环，同时对缺血半暗带细胞功能具有显著的恢复作用[11]。阿替普酶作为一种组织纤溶酶原激活剂，主要经过纤维蛋白溶解酶结合纤维蛋白溶解酶，对纤溶酶原进行激活，形成纤溶酶后起到溶解血块的作用。阿替普酶凝血系统的影响较小，不易出血，因此其溶解血栓能力较强[12,13]。

本文研究结果显示，阿替普酶组大鼠的脑梗死体积、脑组织含水量较少，其ZeaLonga评分较低，趋于正常大鼠，说明阿替普酶治疗脑梗死效果明显，同时可以促进大鼠神经功能恢复。分析原因：阿替普酶对毛细血管中的内皮细胞具有保护作用，保护其细胞的紧密连接的结构功能，可以有效的减轻大鼠脑梗死内皮细胞的肿胀程度，对基膜厚薄有改善作用[14]。GAP-43是一种胞膜磷酸蛋白，与神经发育、轴突再生、突触重建有关，可以调解轴突延伸作用，改变细胞形态，还可以作为细胞内信号，大大增强与G蛋白偶联受体之间的联系[15]。当脑梗死发生时，脑组织损伤部位周围神经元的传入侧支发芽，反应性轴突再生，发生功能代偿性发育，使得GAP-43的表达水平升高[16]。由于血脑屏障遭到破坏，血清中的GAP-43水平也会发生相应的变化。NGF对神经生长和分化具有促进和维持作用。研究显示，脊髓损伤的大鼠，其受伤局部NGF及其受体的水平上升，说明NGF水平升高与神经损伤有一定的相关性[17]。MDA是一种氧化应激反应的标志物，可以根据MDA水平变化了解到机体代偿性变化。MDA是脂质氧化终产物，会加剧细胞膜的受损程度，还可以影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性。肌体大量运动时会对组织器官产生震荡效应，使细胞内代谢产物不断积累导致其渗透压升高，由于细胞膜通透性的可逆性变化，胞内代谢酶逸出，导致血清酶活性升高[18]。本研究显示，阿替普酶组大鼠GAP-43、NGF、MDA水平显著降低。说明阿替普酶可以有效的抑制GAP-43、NGF、MDA水平。其可能的作用机制是PTEN是mTOR通路的负相关的调节因子，抑制PTEN下调，有助于激活mTOR通路，对轴突再生有显著的阻碍作用[19,20]，GAP-43通过下调PTEN、PKA表达，激活mTOR通路，从而抑制GAP-43、NGF、MDA水平。

综上所述，阿替普酶对脑梗死大鼠的治疗效果显著，有助于促进大鼠神经功能恢复，通过调控PTEN、mTOR、PKA信号通路，对GAP-43、NGF、MDA水平起到抑制作用。