利用质谱技术鉴定马铃薯醇溶性致敏蛋白

李佩华，彭正松，赵 欢，周晓利，林 巧，邓 迪

（1.西昌学院农业科学学院，四川西昌 615013；2.西华师范大学生命科学学院，四川南充 637002）

食物过敏是指人们食用某种食物后出现皮肤瘙痒等不良反应，是一种对食物中抗原分子产生的不良免疫介导反应，主要由IgE（immunoglobulin E，免疫球蛋白 E）介导[1]，即通过IgE 使抗体和抗原结合。约1%～3%的成年人及5%～8%的儿童对一种或多种食物过敏[2]。乳糜泻（celiac disease，CD）是病人因摄入来自小麦的麸质蛋白而诱发T 细胞介导的慢性肠炎，是一种特殊的过敏症状[3]。典型的乳糜泻临床症状包括肠黏膜损害和继发的吸收不良，伴有顽固的腹泻、体重下降、营养不良、骨质疏松、贫血、乏力、手足抽搐等。由于人体胃蛋白酶、胰蛋白酶和小肠刷状缘酶缺乏脯氨酸内切酶活性，导致富含脯氨酸和谷氨酰胺的小麦麸质蛋白不能被完全消化，形成的长蛋白肽段聚集在小肠上皮细胞[4]，诱发易感人群产生过敏性免疫反应[5]。小麦麸质蛋白包括谷蛋白（高分子量谷蛋白和低分子量谷蛋白）和醇溶蛋白，其中醇溶蛋白是乳糜泻的主要致敏蛋白[6]。

马铃薯是世界上继小麦、玉米和水稻之后的第四大粮食作物，其储藏蛋白质富含多种人体必需的氨基酸, 因此马铃薯对改善人们的膳食营养结构非常重要[7]。但马铃薯块茎中是否存在可引起乳糜泻的麸质蛋白，目前尚无相关的报道。

本研究利用小麦麸质蛋白的提取液提取马铃薯块茎的蛋白，利用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离目标蛋白，然后切胶收集目标蛋白，酶切后用质谱鉴定蛋白种类，通过相似性比对鉴定包含乳糜泻多肽的马铃薯蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

供试马铃薯（品种）“西芋3 号”由西昌学院马铃薯重点实验室提供。

1.2 马铃薯块茎醇溶性蛋白的提取

将新鲜马铃薯薯块研磨成细粉，取约30 mg 放入1.5 mL 离心管中，加小麦麸质蛋白提取液[8]90 mL，振荡器上充分混匀，95 ℃水浴 5 min，3 000 r/min 离心5 min，取上清液以普通小麦材料“中国春”为对照进行SDS-PAGE 分析（见图1）。

SDS-PAGE 方法参照文献[8]进行：10%的丙烯酰胺分离胶含 1 mL 40% Acr、0.52 mL 2% Bis、1 mL Resolving gel、0.09 mL 10%（W/V）过硫酸胺、4.2 μL TEMED、5.2mL H2O；3%的丙烯酰胺浓缩胶含0.375 mL 40% Acr、0.2 mL 2% Bis、0.62 mL Stacking gel 缓冲液、0.04 mL 10% SDS（W/V）、0.05 mL 10%（W/V）过硫酸胺、5 μL TEMED、3.7 mL H2O。

1.3 目的蛋白的质谱分析

真空干燥回收的蛋白胶块，然后用胰蛋白酶胶内水解蛋白成多肽，参照文献[9]的方法进行LTQ-质谱检测（Thermo Finnigan；中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质研究分析中心）。使用BIOWORKS 软件搜索NCBI 的Solanum tuberosum 质谱数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/peptidome），查找与质谱多肽相对应的马铃薯蛋白，构建本地马铃薯醇溶性蛋白数据库。检测参数为：当 Charge+1，Xcorr≥1.9；当 Charge+2，Xcorr≥2.2；当 Charge+3，Xcorr≥3.75；其中 DelCN≥0.1。

1.4 生物信息学分析

采用GO miner 软件对蛋白进行基因本体（Geneontology，GO）聚类分析。在 WEGO 数据库（http：//wego.genomics.org.cn/）中进行生物学通路分析。

1.5 马铃薯醇溶性致敏蛋白的鉴定

从 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载质谱检测到的马铃薯蛋白的全序列，然后通过序列比对明确这些蛋白是否含有已知的乳糜泻多肽（见表1），具体方法如下：通过BioEdit（v7.2.5）软件提供的本地BLAST-P 程序进行全序列比对，根据两者之间的序列相似性筛选潜在的马铃薯醇溶性致敏蛋白，设置参数期望值（E-value）为 1，矩阵（Matrix）为BLOSUM62，其他参数为默认值。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE

SDS-PAGE 表明，在马铃薯块茎蛋白泳道观察到3 条与“中国春”的低分子量谷蛋白和醇溶蛋白迁移率相似的蛋白，回收这3 条蛋白条带，胰蛋白酶水解，用于质谱分析。

图1 马铃薯品种“西芋3 号”和普通小麦“中国春”麸质蛋白的SDS-PAGE 分析Figure 1 SDS-PAGE analysis of potato cultivar“xiyu 3”and common wheat“Chinese Spring”

2.2 马铃薯中致敏蛋白的识别

质谱鉴定共检测199 种不同的马铃薯蛋白（见表1）。下载这199 种蛋白的氨基酸全序列，并将其与已知的乳糜泻多肽（见表1）进行比对，未发现其含有潜在的致敏多肽。

表1 已知可导致乳糜泻的小麦麸质蛋白多肽Table 1 Reported celiac disease (CD) epitopes in wheat seed storage proteins

2.3 蛋白的功能分析（GO分析）

分析199 种马铃薯蛋白的GO 注释结果（见图2），发现参与细胞（cell，GO：0005623）、细胞部分（cell part，GO：0044464）和细胞器结构组成（protein-containing，GO：0043226）的蛋白分别占 14.9%、14.9%、11.9%。在分子功能中，蛋白主要以催化功能（catalytic activity，58.4%，GO：0003824）和结合功能（binding，47.5%，GO：0005488）为主。参与生物学过程有7 个子类，其中大部分蛋白参与代谢过程（metabolic process，64.4%，GO：0008152）、其次是参与细胞过程（cellular process，41.6%，GO：0009987）和对刺激的响应过程（response to stimulus，9.9%，GO：0050896）。

图2 质谱检测到的199 种马铃薯蛋白的GO 分析Figure 2 GO analysis of the 199 proteins identified by mass spectrum

3 讨论

2015 年初，农业部确定了马铃薯主粮化战略，这意味着马铃薯的种植面积将会增加，有利于保障粮食安全。主粮化意味着马铃薯将实现由副食向主食的转变，我国居民食用马铃薯的人数和频率将显著增加，这将改善我国居民的膳食结构。但是，部分人群可能对马铃薯过敏，因此有必要系统研究马铃薯的致敏原。黄静等[20]通过生物信息学方法初步分析了马铃薯的致敏蛋白序列，发现了11 条潜在的内源性致敏蛋白。但是，仍有必要通过实验进行验证。

乳糜泻是一种危害严重的遗传性疾病，最有效的治疗方法是严格的无麸质饮食[13]。但是，目前尚不清楚马铃薯是否含有乳糜泻多肽。我们通过蛋白提取、纯化、酶切、质谱分析和相似性搜索，证明马铃薯不含有可导致乳糜泻的麸质蛋白，这为系统推进马铃薯的主粮化安全性评价提供了必要支持。

目前已知的乳糜泻多肽均来自小麦麸质蛋白，尤其醇溶蛋白[3]。醇溶蛋白是一种特异溶解于70%乙醇溶液的蛋白。小麦醇溶蛋白有成熟的提取方法，已广泛应用于小麦的加工品质研究[8]。本研究直接利用小麦的醇溶蛋白提取方法提取马铃薯的醇溶性蛋白，有利于借鉴小麦的成熟技术，保证实验顺利开展。已报道的乳糜泻多肽富含谷氨酰胺（Q）和脯氨酸（P）（表1），由于马铃薯和小麦的亲缘关系较远，同源蛋白的序列相似性较低，这导致不能排除小麦的提取液不能完全提取马铃薯醇溶性蛋白的可能性。因此，有必要继续尝试其他提取方法进一步验证本研究的结果。