一株拮抗烟草炭疽病的菌株ZYY-4的筛选、鉴定及生防活性测定

翟颖妍 ，崔传斌，张家韬，安 航，尚学勤，安德荣*

（1.西北农林科技大学植物保护学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100；2.陕西省烟草公司烟草科学研究所，西安 710002）

烟草炭疽病（Colletotrichum nicotianae Averna）作为半知菌真菌，是烟草重要病害之一[1]。调查发现[2]烟草炭疽病发病严重时会毁掉整片烟田，给农户带来严重损失，同时阻碍相关产业健康生产。烟草炭疽病在烟草全生育期均可发病，苗期发病最重，主要危害叶片、茎秆，叶部发病最重，且在多雨潮湿年份蔓延速度快。目前农业生产上对烟草炭疽病的防治主要依靠化学药剂，如多菌灵、炭疽福美等[3]。

在越来越提倡减肥减药、绿色农药的今天，生物防治是植物病害防治的发展趋势和研究热点。芽孢杆菌作为一种根际促生细菌（PGPR）[4]，拥有适应能力强及稳定性强、在占领空间及生存竞争方面占绝对优势，同时具有对人畜低毒且绿色环保的优点，受到微生物制剂研究工作者的重视。甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）最早从水稻根际土壤中分离得到[5]。近来国内外已有甲基营养型芽孢杆菌防治葡萄灰霉病、香蕉枯萎病、烟草赤星病、黄瓜炭疽病、玉米茎腐病和人参锈腐病等[6-11]的报道。另外，还有报道称甲基营养型对番茄及草莓[12-13]具有促生作用。

高效菌株的筛选是微生物制剂的研究及应用基础，为顺应新型微生物农药绿色投入品的研发趋势，本研究从秦岭太白山森林土壤样本中经分离纯化、定向筛选、对抑菌能力强的菌株进行鉴定，然后进行温室盆栽实验，旨在寻找具有应用价值的菌株，并为烟草炭疽病生防提供依据，丰富有益微生物资源库。

1 材料和方法

1.1 试验材料

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g 煮沸滤液、葡萄糖20 g、琼脂20 g，加蒸馏水定容至1000 mL，自然pH 值，121 ℃高温高压灭菌30 min。

LB（luria-bertani）液体培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10g，自然 pH，加蒸馏水定容至1000 mL。121 ℃高温高压灭菌30 min。

LB（luria-bertani）固体培养基：胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，琼脂 18 g，自然 pH，加蒸馏水定容至1000 mL。121 ℃高温高压灭菌30 min。

供试病原菌：棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、马铃薯早疫病菌（Alternaria solani.Sorauer）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）。均由西北农林科技大学植物保护学院资源微生物实验室保存。

供试烟草：K326 烟草，由陕西汉中市公司烟草试验站提供。

供试药剂：50%多菌灵可湿性粉剂，河南金光农业科技有限公司。80%炭疽福美可湿性粉剂，石家庄市绿丰化工有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗菌的分离

使用土壤取样器从秦岭太白山森林中采集土样，取5～10 cm 深度的土壤。称量10 g 土壤样品加入30 mL 无菌水，于28 ℃下振荡培养30 min。混匀取1 mL 样品溶于9 mL 无菌水中得到10-1稀释液，依次得到 10-2、10-3、10-4、10-5稀释液。用移液枪吸取100 L 溶液均匀涂布在LB 平板上，倒置于30 ℃下培养2～4 d，观察菌落形态，选择不同的独立单菌落，经过平板划线进行纯化培养，将得到的纯化菌落斜面培养，保存在4 ℃冰箱。

1.2.2 拮抗菌的筛选

拮抗菌的初筛：将4 ℃保存的烟草炭疽病病原接种于PDA 培养基上活化，用灭过菌的打孔器（5 mm）打菌饼，再用灭过菌的挑针接烟草炭疽病菌饼于PDA 平板正中央，采用十字交叉法接2 L 纯化分离的细菌菌液于等距的四端[14]。只接烟草炭疽病菌的PDA 平板作为对照，28 ℃下培养，观察并记录菌落直径，并计算抑制率。

拮抗菌的复筛：将拮抗表现较强的候选菌株，在液体LB 培养基内220 r/min 振荡培养48 h，然后经12 000 r/min 离心3 min，将上清液经0.22 m 针筒式微孔滤膜过滤器过滤得到无菌滤液，使用生长速率法[15]取 10 mL 滤液加入 90 mL 温的 PDA 培养基中混匀，倒板，在中央接种靶标菌株，10 mL 的LB液体培养基与90 mL 温的PDA 处理液作为对照，观察。记录菌落直径，计算抑制率，筛选得到最好的一株进行后续试验。

抑制率/%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

拮抗菌株的广谱活性测定：棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、马铃薯早疫病（Alternaria solani.Sorauer）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）5 株植物病原菌采用十字交叉法进行对峙实验，方法同上。

1.2.3 拮抗细菌ZYY-4 的鉴定

对筛选得到的斜面保存的拮抗细菌用无菌水进行梯度稀释，用移液枪吸取150 L 溶液接至LB平板。用灭过菌的涂布器均匀涂抹，于28 ℃下培养2～3 d，观察菌落形态。使用《伯杰氏细菌手册》[16]及《常见细菌系统鉴定手册》[17]对ZYY-4 进行生理生化鉴定。

16S rDNA 序列分析：用SK8255 试剂盒对30 ℃下培养2d 的菌落提取基因组DNA，送往上海生工股份有限公司测序。细菌16S rDNA 通用引物为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。以提取的基因组DNA 为模板进行PCR 扩增测序[18]。将测定的序列在GenBank 中进行 BLAST 比对。 使用 MEGA7.0 进行系统发育树构建。

1.2.4 拮抗细菌ZYY-4 的防治效果测定

将烟草炭疽病病原接种到PDA 培养基上培养5～10 d，制成 1.0×106cfu/mL 的菌悬液，备用。接ZYY-4 菌落于 LB 液体培养基内 28 ℃，220 r/min 条件下培养48 h，配置得浓度为3×108cfu/mL 的ZYY-4发酵液。温室盆栽试验在西北农林科技大学植物保护学院温室内进行。将灭过菌的基质营养土和灭菌的土壤等体积混合后铲入育苗盘里。在育苗温室内培育烟苗至4～5 叶期时进行防治效果实验。将长势一致的烟苗随机分组，每组10 株。采用叶面喷施的方法进行防治效果测定。

预防实验：对盆栽烟苗喷施ZYY-4 发酵液（3×108cfu/mL），以 50%多菌灵可湿性粉剂（800 倍液）、80%炭疽福美可湿性粉剂（300 倍液）及无菌水作为对照。48 h 后再喷施烟草炭疽病孢子悬浮液，每处理重复4 组。温室内培养7 d，观察并记录发病情况，参照（GB/T 17980.112-2004）进行烟草炭疽病病情调查[19]。计算病情指数及防治效果。

治疗实验：先喷施烟草炭疽病孢子悬浮液到盆栽烟苗上。6 h 后再分别接种ZYY-4 发酵液（3×108cfu/mL），以 50%多菌灵可湿性粉剂（800 倍液）、80%炭疽福美可湿性粉剂（300 倍液）及无菌水作为对照。每处理重复4 组。温室内培养7d，观察并记录发病情况。 计算病情指数及防治效果。

病情分级按0 级，无病；1 级，病斑面积占整片叶面积的5%以下；3 级，病斑面积占整片叶面积的6%～10%；5 级，病斑面积占整片叶面积的11%～25%；7 级，病斑面积占整片叶面积的 26%～50%；9 级，病斑面积占整片叶面积的50%以上。

病情指数/%= [Σ（各级发病病叶数×相应级数）]/[调查总叶数×9]×100%

防治效果/%=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100 %

1.2.5 数据分析

使用SPSS17.0 软件对实验数据进行处理分析，采用Duncans 氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的分离筛选

从秦岭森林土壤中采集共得到20 份土样，分离出143 株细菌。以烟草炭疽病为靶标，通过平板对峙初筛和生长速率法复筛得到3 株对烟草炭疽病抑制能力较强的菌株，抑制率均大于50%，如下表1 所示。其中ZYY-4 菌株对烟草炭疽病拮抗作用最强，其抑菌率达69.93%，因此选择ZYY-4 作为后续实验菌株。

对ZYY-4 的广谱抑菌活性进行测定，使用棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、烟草赤星病菌（Al-ternaria alternata）、马铃薯早疫病菌（Alternaria solani.Sorauer）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）5 种病原菌作为靶标，ZYY-4 对烟草赤星病菌、小麦根腐病菌、马铃薯早疫病菌、玉米大斑病菌4 种病原菌的抑制率均达到60%以上，因此ZYY-4 具有良好的广谱抑菌活性。结果如下表2 所示。

表1 拮抗菌株对烟草炭疽病菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of antagonistic strains on tabaco anthracnose

2.2 ZYY-4的生理生化特性

ZYY-4 单孢菌落在LB 平板上生长良好，革兰氏染色呈阳性。培养24 h 菌落呈圆形表面有光泽略黏稠，无色透明；培养48 h 呈乳白色，表面干褶不光滑不透明，有褶皱，边缘不整齐锯齿状。镜检细胞呈杆状产芽孢，如图1 所示。初步认定ZYY-4 为芽孢杆菌属细菌。其生理生化特性如下表3 所示。

表2 ZYY-4 的广谱抑菌活性Table 2 Inhibition rate of ZYY-4 towards plant pathogens

图1 单孢培养下ZYY-4 形态（A）、革兰氏染色（B）、芽孢革兰氏染色（C）Figure 1 Morphology of ZYY-4 under Monospore culture(A)、Gram's staining(B)、Gram's spore staining(C)

表3 菌株ZYY-4 的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain ZYY-4

2.3 ZYY-4的分子生物学鉴定

以ZYY-4 基因组DNA 为模板扩增得到的DNA 片段如下图2所示，ZYY-4 的 16S rDNA 核苷酸序列长度为1372bp。将测序得到的序列与GenBank 中的序列进行Blast 比对，发现ZYY-4 与甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）同源性达到99%以上。使用MEGA 7.0 软件构建的系统发育树如图3 所示，结果表明ZYY-4 与甲基营养型芽孢杆菌相似性高达100%。

2.4 ZYY-4对烟草炭疽病的盆栽防效结果

ZYY-4 的温室防效实验结果如下图4 及表4所示。与无菌水处理相比，其他3 种处理都有一定的防治效果，并且预防实验防效均大于治疗实验防效。预防试验中：施药7 d 后ZYY-4 发酵液（3×108cfu/mL）、50%多菌灵800 倍液、80%炭疽福美可湿性粉剂300 倍液的防治效果分别为77.83%、86.6%、77.5%，ZYY-4 发酵液的效果位于第 2，高于炭疽福美。说明ZYY-4 对烟草炭疽病有较好的预防防治作用。治疗实验中：施药7d 后ZYY-4 发酵液（3×108cfu/mL）、50%多菌灵 800 倍液、80%炭疽福美可湿性粉剂300 倍液的防治效果均在60%以上，50%多菌灵800 倍液的防治效果达到75.85%，ZYY-4 发酵液结果为62.77%，而炭疽福美的防治效果为67.23%，略高于ZYY-4。在温室盆栽条件下50%多菌灵在预防实验和治疗实验中均对烟草炭疽病的防治效果最好，ZYY-4 的防治效果基本和80%炭疽福美达到了同等防治水平。

图2 ZYY-4 菌株16S rDNA 序列的PCR 扩增结果Figure 2 PCR amplification of 16S rDNA sequence of Strain ZYY-4

3 讨论

本文从秦岭太白山森林土壤中分离、筛选得到一株对烟草炭疽病有良好防效的ZYY-4 菌株。对峙实验中ZYY-4 对烟草炭疽病的抑制率达到69.93%。经广谱抑菌活性测定，结果显示ZYY-4 对烟草赤星病菌、小麦根腐病菌、马铃薯早疫病菌、玉米大斑病菌4 种其他植物病原菌也有较好的抗性，有较好应用前景。经过培养特性、生理生化分析及16S rDNA 鉴定确定ZYY-4 为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。温室盆栽实验表明该ZYY-4 液体发酵液对烟草炭疽病的预防效果达77.83%。虽然低于化学药剂多菌灵，但是与化学药剂炭疽福美的防效相当，证明其具有进一步研究微生物菌剂的潜力。

现阶段对烟草炭疽病的防治主要通过化学药剂，目前针对烟草炭疽病的生防菌剂研究较少，万秀清等[20]报道一株荧光假单孢菌株对烟草炭疽病有拮抗作用，陈越等[21]发现贝莱斯芽孢杆菌菌株C-4的发酵液对烟草炭疽病有生防活性，短小芽孢杆菌AR03[22]被报道对烟草炭疽病菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用。目前虽然已发掘出了许多生防资源，但至今仍无高效防治烟草炭疽病的生防菌剂广泛投入实际农业应用。ZYY-4 菌株是一株被报道的对烟草炭疽病有较强拮抗活性的甲基营养型芽孢杆菌，具有较大的研发潜力。但该菌的拮抗机制尚不清楚，且温室盆栽条件与大田条件存在较大差异，要将其进一步推广到大田实际应用，还需对其抗菌机制、发酵条件、剂型加工及田间应用技术进一步研究。

表4 ZYY-4 温室盆栽防效实验Table 4 Result of greenhouse pot experiment of ZYY-4