瘤胃微生物宏组学分析及研究进展

盖叶顶，王后福，王淑玲，矣 国，李鹏飞，杨仁辉，周荣康，杨 振，成 潇，冷 静

（云南农业大学云南省动物营养与饲料重点实验室，云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201）

反刍动物瘤胃是由细菌、真菌、古菌、原虫、病毒等多种微生物共同参与、具有发酵功能的复杂器官，可将纤维物质转化成反刍动物日常活动所需能量，在调节宿主生理功能、代谢反应和抵御病原体等方面发挥着重要作用。相比传统微生物纯培养研究方法，宏组学研究通常旨在确定一组微生物、基因、变异体、途径或代谢功能，以描述未培养样本中的微生物群落[1]，因此利用宏组学策略能在系统层面解释微生物-宿主之间的相互作用及代谢途径，以更好分析瘤胃微生物在饲料利用率、功能基因筛选、减少畜牧业污染中的作用。本文介绍了近年来宏组学方法在反刍动物瘤胃微生物上的应用，为宏组学在瘤胃微生物研究上的运用提供参考和依据。

1 宏组学

宏组学是指微生物群落不依赖于培养的分析方法，包括宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学、宏代谢组学技术等组学研究[2]。宏基因组学通过提取特定环境（胃肠道、土壤、海洋、污水等）微生物总DNA，进行分析得出环境中微生物多样性及分子生物学信息。宏转录组学从微生物总RNA水平上研究复杂微生物活动状态，反映所形成蛋白质的种类、数量、修饰以及发挥功能的位置或区域等，其发挥功能作用还需要用宏蛋白质组学进行验证。（宏）蛋白质组学方法可以分析剪接变体和共翻译和翻译后修饰，以及蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质复合物的检测[3]。宏代谢组学通过确定代谢产物被释放到环境中来完成功能网络图谱。宏组学数据结合起来分析能进一步揭示特定环境微生物功能、代谢活动之间的联系。

2 宏组学在瘤胃微生物中的应用

2.1 宏基因组学在瘤胃微生物中应用 宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新颖微生物研究方法[4]。与其他关于瘤胃微生物群的研究一样，宏基因组学被用来更好地分析微生物与淀粉酶解、纤维降解、甲烷排放的关系。

瘤胃微生物是反刍动物进行饲草料降解的重要部分。宏基因组学最初的研究是确定反刍动物瘤胃内的微生物主要种类及优势菌群。不同反刍动物在门水平瘤胃微生物优势菌群不同[5-12]（表1），其中大部分是硬壁菌门、拟杆菌门、变形菌门。而对RDP数据库中所有瘤胃来源的16S rRNA基因序列进行分析，也表明瘤胃中大部分细菌属于厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门[13]。厚壁菌门是分解纤维的主要菌门，含有大量的降解纤维素的菌属[14]。

基于宏基因组学方法能够分析出大量瘤胃微生物功能性基因，在首次进行瘤胃微生物宏基因组学深度测序中，Brulc等[15]发现了糖苷水解酶和纤维素功能基因。在这之后对瘤胃微生物功能性酶基因的筛选得到了广泛研究。在海子水牛瘤胃微生物功能基因研究中发现，有38 011个基因编码蛋白质具有木质纤维素降解酶活性，其中归属于GH2、GH43、GH97、GH3家族的基因较多[16]；在骆驼瘤胃微生物发现1种新的耐热木聚糖酶基因（PersiXyn1），在pH 8和40℃下酶活性保持在80%以上[17]。同时瘤胃宏基因组学分析能够得到较多未被开发的微生物酶源。在骆驼瘤胃中对附着植物纤维上的微生物进行分析，发现促进木质纤维素降解和挥发性脂肪酸（VFA）发酵的关键物种，表明骆驼瘤胃的微生物群是一种密度很大，仍未被开发的微生物酶源[18]。对温室气体甲烷排放进行研究，通过分析宏基因组学数据发现了甲烷生成基因mcrA和fmdB与甲烷排放相关[19]。瘤胃微生物宏基因组数据与数据库中微生物物种和功能进行对比，将是寻找用于工业相关领域功能性酶基因重要来源之一。

2.2 宏转录组学在瘤胃微生物中应用 宏转录组学是研究一定时间和空间下细胞转录的所有RNA，从转录水平上分析特定时期群体生命体的全部基因组转录情况以及转录调控规律。相比宏基因组学，宏转录组学能够在表达水平反映瘤胃微生物种类、多样性和潜在基因功能。Li等[20]应用宏基因组学和宏转录组学技术分析表明，RNA水平上的个体间功能变异高于DNA水平。运用宏转录组方法对麝牛瘤胃微生物总mRNA进行测序分析，编码序列与KOG、CAZy以及COG数据库比对，鉴定出1 000个植物细胞壁降解酶，发现了893个碳水化合物活性酶，而在宏基因组的测序序列中只发现了103个碳水化合物活性酶[21]，表明宏转录组在微生物活性酶发现上优于宏基因组，能够发现更多纤维降解微生物种类及家族基因。在奶牛瘤胃微生物宏转录组研究中，发现糖苷水解酶（GH）家族基因在瘤胃碳水化合物降解中起主要作用，并强调了真菌和纤毛原生动物对多糖降解的重要贡献[22]。在饲喂玉米秸秆后特定时间下进行瘤胃微生物宏转录组分析中，发现纤维素、半纤维素、寡糖降解过程起主要作用的微生物种类，其中瘤胃球菌属、纤维杆菌属和普氏菌属是主要的植物细胞壁多糖降解菌，瘤胃厌氧真菌中的新美鞭菌属、梨囊鞭菌属、根囊鞭菌属和纤毛原虫中的前毛虫属、多甲多泡毛虫属在纤维素和半纤维素降解过程中也发挥着重要作用[23]。宏转录组学和宏基因组学虽能发现瘤胃微生物的功能作用，但瘤胃内微生物的休眠和凋亡等活动都会使测序结果与实际情况关联分析出现偏差，这种偏差则需要通过其他组学共同进行矫正。

2.3 宏蛋白质组学在瘤胃微生物中应用 宏蛋白质组学分析是在给定的时间点描述瘤胃微生物群落的基因表达蛋白情况。与宏基因组相比，宏蛋白质组在揭示反刍动物饲料利用效率所涉及的关键酶的作用方面更具优势。在瘤胃微生物蛋白质早期研究中，通过富集步骤识别纤维素结合蛋白，分析得到纤维素酶、琥珀酸杆菌、马氏梭菌的外生葡聚糖酶[24]。随着测序技术发展，高性能的MS平台使用，提供了更先进和更有针对性的蛋白质组测量及高级宏蛋白质组分析[25]。在一项基于2D SDS-PAGE技术研究表明，通过液质联用测定饲喂高浓缩饲料奶牛中瘤胃消化产物蛋白质，揭示了原核生物蛋白质组主要是参与糖酵解的酶，例如甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸丙糖异构酶，其中酶主要来自厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌（Bacteroidetes phyla）；同时发现产甲烷古菌的酶是最容易识别的蛋白质之一，表明宏蛋白质组学在探索反刍动物低排放表型方面发挥作用[26]。在一项更详细的瘤胃微生物宏蛋白质组学研究中，通过对8 163种定量细菌蛋白的分析，发现有166种不同丰度的碳水化合物活性酶，并且大多数表达的糖苷水解酶属于57家族和2家族，另外发现在富含纤维的饮食中，与丁酸酯形成相关的蛋白质比例很高[27]。与宏转录组结果相比，宏蛋白质组能够反映环境活性微生物的表达。通过对宏蛋白质组学与宏转录组学预测的蛋白功能比对分析中，发现在这些表达的基因中，有71%数据与宏蛋白组相匹配，其中延伸因子Tu、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和磷酸甘油酸激酶与转录数据的匹配最为丰富[28]。形成差异的原因可能是实验技术未能覆盖到所有微生物，但随着生物信息学和技术进步样品的覆盖率将会得到显著提高。

表1 瘤胃微生物细菌主要菌群

2.4 宏代谢组学在瘤胃微生物中应用 宏代谢组学是对微生物群落产生的代谢物的系统分析。宏代谢组学常使用核磁共振、液质联用、气质联用、质谱方法和分离技术来分析存在的代谢物，在瘤胃微生物代谢组研究中使用质谱法和液相色谱法是目前应用最广泛方法，并且由于瘤胃代谢产物的多样性，可能需要多个实验平台进行测定。Saleem等[29-30]和Ametaj等[31]利用各种方法及实验平台检测200多种瘤胃代谢物，包括磷脂、无机离子、气体、氨基酸、短链脂肪酸和碳水化合物等，并结合其他文献提供的87个代谢相关数据建立瘤胃液代谢物数据库，包括246种被确认和量化的瘤胃代谢物或代谢物种（对应334种独特的结构）。瘤胃代谢产物在饲喂不同比例日粮中很容易被区分。Zhao等[32]通过检测大量与氮代谢有关的代谢产物，得出代谢物高度依赖于饮食组成，氨基酸代谢物和甲基胺（作为甲基化甲烷生成的底物）有显著差异。在关于颗粒饲料影响瘤胃上皮代谢物的研究中，发现颗粒饲料明显增加瘤胃上皮中8种代谢物的水平，降低了瘤胃上皮组织中7种代谢物的浓度[33]。因此，要深入了解瘤胃微生物代谢物质的产生及如何影响宿主的生理生化变化，宏代谢组学单独应用并不能解决其问题。

3 宏组学联合在瘤胃微生物中应用

目前在瘤胃微生物研究中应用宏组学联合分析还处于起步阶段，其中Li等[20]对比宏基因和宏转录数据，分析3个品种牛的瘤胃微生物功能活动与饲料利用效率联系，发现高、低饲料效率牛的瘤胃微生物特征（如分类群、多样性指数、功能类别和基因）差异很大，其中饲料利用效率高的牛瘤胃微生物多样性低于饲料利用效率低的牛，并推测其原因是饲料利用效率高的牛瘤胃微生物产生的代谢物范围较小，产出用于宿主利用的代谢物质数量增多，可满足动物的能量需求；而饲料利用效率低的牛瘤胃微生物则相反，并且饲料利用效率低的牛瘤胃微生物可能具有较高的氮代谢，产生更多甲烷气体，造成能量损失。Shabat等[34]结合宏基因组和代谢组数据对瘤胃微生物群进行了组成、微生物活性和代谢物分析，表明较低丰富度的微生物体基因含量和分类群与较高的饲料效率密切相关，并且微生物群中微生物的特定富集和代谢途径使动物获得了更好的能量和碳通道，同时减少了甲烷向大气的排放，并与Li等[20]推测相同。

在结合3种组学数据分析中，Deusch等[27]将宏基因组、蛋白质组学和代谢组学相结合分析，揭示了普雷沃氏菌科是一个代谢功能广泛的群体，在浓缩和富含纤维的饲料消化中占据主导地位，并且代谢组学提供了有关瘤胃微生物代谢活动的详细信息。这项研究为深入了解细菌相互作用的复杂网络，以及对各种底物的适应提供了更深入的见解。在应用宏组学方法分析饲粮添加剂对瘤胃微生物的影响中，Ogunade等[35]通过对16S rRNA测序和代谢组数据分析发现酵母补充剂增加了8个纤维分解细菌属、Anaerovorax和Lachnospiraceae丰度，活酵母补充增加了乙二醇环己二酮二缩酮和吡喃葡萄糖苷的浓度，并降低了苏阿糖酸、黄嘌呤核苷、脱氧胆酸、月桂酰肉碱、甲氧基苯甲酸和十五烷基苯甲酸的浓度；bacteroidales BS11，Christensenellaceae R-7和Candidatus saccharimonas与氨基酸生物合成和能量代谢相关代谢物呈正相关。而Belanche等[36]通过体外瘤胃模拟技术，结合宏基因和代谢组学揭示了饲草保存方法和添加维生素E对瘤胃微生物群功能和代谢产物的影响，实验表明干草日粮可增加细菌多样性指数。相反，维生素E的补充降低了多样性指数；同时干草日粮的产甲烷菌多样性高于青草日粮，但均匀度没有表现出甲烷菌种类数量的减少；添加维生素E能提高瘤胃发酵的TVFA和产气量，当提供乙酸α-生育酚与α-生育酚时原生动物活性较高。以上宏组学联合分析中，虽提供了微生物与日粮、代谢物之间关系分析方法，但并不能对某种微生物代谢情况进行全面揭示，需要在今后研究中结合相关实验技术来揭示其功能特征，从系统层面理解瘤胃微生物代谢情况。

4 宏组学数据分析软件

宏组学数据分析软件对探究微生物基因功能全面性及深度有重要影响，组学数据拥有较高的数据量，并且测序深度和覆盖范围也会影响实验的结果，合理运用软件处理大量的组学数据是大部分研究人员关心的问题。目前有较多软件用于组学数据的分析，在代谢组学和蛋白质组学数据分析中，沃特世推出了LC-MS生物信息学产品Progenesis QI组学分析软件，此软件能够精确地定量分析和鉴定，并发现样品中的相关生物标记物[37]。在分析比较代谢组数据软件研究中，梁丹丹等[38]总结了13种功能软件基本信息，并着重介绍和对比4种具有代表性软件用于代谢组学数据分析，包括MAVEN、MZmine、MetaboAnalyst和XCMS Online软件。而在宏基因组数据比较分析中，第一种被命名为XIPE-TOTEC的工具提供了2个样本测试，并以宏基因鸟枪法序列作为输入[39]。对环境微生物数据分类上，Huson等[40]对Megan进行重写和扩展，增强了对大型微生物群数据集的分类和功能内容进行交互分析。由于宏组学产生的较多数据信息，数据的产生速度远高于分析软件的发展速度，产生的大量数据未能得到充分分析。因此需要能够处理整合宏组学分析的工具。目前，FANTOM和MetaComp软件具有综合分析形式。FANTOM软件能够加强2组宏基因组样本之间的比较能力，同时，允许探索性和比较分析宏基因组学丰度数据，重要的是，FANTOM可以使用任何层次数据库，它提供了NCBI分类层次结构，以及KO、COG、PFAM和TIGRFAM数据库[41]。MetaComp的图形综合分析软件，可对宏基因组学和其他组学数据进行多元统计、双样本、多样本的假设检验等分析，并对环境因素进行新的函数回归分析[42]。宏组学综合分析是组学研究的前沿，目前环境微生物宏组学的综合分析还未形成统一分析方式，需要相关研究人员不断探索，为描述微生物之间的关系提供帮助。

5 展 望

反刍动物瘤胃微生物具有复杂性、多样性等特点，对瘤胃微生物群落、功能、代谢途径等研究应用宏组学联合分析具有显著优势。同时，应将宏组学与其他相关实验技术结合，全面分析微生物功能作用，用以找寻微生物-代谢物-宿主之间联系的桥梁及分子途径，并对其微生物代谢途径进行干预。随着高通量测序成本逐渐降低，通过宏组学技术探究反刍动物瘤胃微生物优势菌群、微生物功能的研究势必会成为主要方向，并向各器官组学、血液和牛奶代谢组学、神经系统等方向发展，其内部生理代谢途径和方式将得到解释，从而更好地揭示日粮、环境、基因、疾病等对宿主影响。