牛胚胎玻璃化冷冻技术研究进展

张培培，郝海生，杜卫华，庞云渭，刘 岩，赵善江，赵学明，朱化彬

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，家畜胚胎工程与繁殖创新团队，北京 100193）

冷冻保存是将胚胎置于超低温（-196℃）的液氮中保存，使细胞代谢速率下降，并能长期稳定保存[1]，解冻后可用于胚胎移植。胚胎的冷冻保存是辅助生殖技术的重要手段。1972年由Whittingham等[1]第1次成功冷冻保存了小鼠胚胎，之后胚胎冷冻技术在家畜繁殖生物技术的应用日益广泛。冷冻保存技术可以实现将体内和体外生产的胚胎冷冻保存起来跨时空运输，促进这些胚胎在胚胎移植行业的广泛使用，这将增加胚胎移植带来的潜在收益。据2015年国际胚胎移植协会（IETS）统计数据显示，全世界共移植牛体内胚胎520 535枚、体外胚胎427 810枚，其中冷冻体内胚胎达60.91%（317 386枚）、冷冻体外胚胎达25.97%（111 098枚）。胚胎冷冻技术在牛胚胎移植产业中发挥着日益重要的作用。

根据冷冻过程中降温速率的不同，将胚胎冷冻保存技术分为慢速冷冻法、快速冷冻法和玻璃化冷冻法3种。目前，在生产实际中广泛使用慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。本文从冷冻方法、抗冻保护剂、产业应用等角度对牛胚胎冷冻技术进行总结和分析，旨在为从业人员提供相关的理论知识和技术参考，进而推动牛胚胎冷冻技术的进一步优化和更广泛的产业化应用。

1 冷冻方法

1.1 慢速冷冻法 慢速冷冻法是利用冷冻设备，加入低浓度的冷冻保护剂使细胞脱水，以低于1℃/min的速度降到-30～-80℃时，放入液氮中保存。冷冻过程中，细胞外的冷冻保护剂进入细胞质以补充流失的水分，完成细胞内外溶液的交换，当温度降到0℃以下时，由于细胞外盐浓度升高，细胞外冰晶的形成进一步增加了外界渗透压，使细胞脱水收缩[2]。Whittingham等[1]首次报道了慢速冷冻法，Wilmut等[3]首次对牛胚胎用慢速冷冻法冷冻，解冻后胚胎移植成功生出小牛。慢速冷冻是牛胚胎冷冻保存的传统方法，囊胚扩张率可达89%，孵化率为66%[4]。

在慢速冷冻过程中，细胞内水的不稳定过冷状态可能会导致细胞内冰晶的形成，通过在低温下加入非渗透性冷冻保护剂（如蔗糖）使细胞与冷冻保护剂保持渗透压平衡来减少大冰晶的形成。慢速冷冻需要控制速率的冷冻设备，冷冻过程花费时间较长，且胚胎的存活率和着床率较低，并有可能导致纺锤体异常[5]，这些因素限制了慢速冷冻技术的广泛应用。

1.2 玻璃化冷冻法 玻璃化冷冻方法是通过添加高浓度的冷冻保护剂使细胞脱水，在0℃以上直接投入液氮中，使其快速冷却（15 000～30 000℃/min）。液体粘度增加，当达到临界值时发生凝固化，使细胞形成无结构的玻璃态，避免了细胞内冰晶的形成[6]。Rall等[7]首次用玻璃化冷冻方法成功冷冻保存了小鼠胚胎，随着近几十年来的改进，玻璃化冷冻法已经成为最可靠的冷冻方法。玻璃化冷冻能够降低冷冻保护剂的毒性，并且能够使胚胎有较高的存活率和着床率，更重要的是玻璃化冷冻不会形成冰晶，避免了对细胞或组织的损伤。

由于玻璃化冷冻可以避免牛胚胎在缓慢冷冻过程中的冷敏感性，因此玻璃化方法冷冻牛胚胎的存活率（81%）比慢速冷冻胚胎的存活率（60%）更高[8]。研究表明，玻璃化冷冻牦牛胚胎的囊胚扩张率、孵化率和妊娠率也更高[9]，胚胎经玻璃化冷冻后效果更好。虽然玻璃化冷冻还存在一些问题，但是相信未来这种方法的应用有很大前景。

2 玻璃化方法

目前，由于玻璃化冷冻技术的应用具有相对简单、快速经济、存活率高、保存期短等优点，玻璃化冷冻是胚胎冷冻的首选方法。虽然玻璃化冷冻技术已在许多物种胚胎的冷冻保存方面发挥了作用，但为了进一步提高怀孕率和产仔率，科研人员从承载工具、冷冻液成分等角度进行了优化和完善。

2.1 承载工具

2.1.1 Open Pulled Straw（OPS）冷冻法 如图1所示，OPS冷冻法是将标准的塑料吸管加热拉到管直径和厚度的一半，将含有胚胎的冷冻液（约0.1 µL）吸到OPS管的末端，最后将OPS管直接投入液氮中冷冻保存[10]。随着1997年OPS法的发明，Vajta等[11]首次用OPS法玻璃化冷冻牛胚胎，用OPS法冷冻的牛胚胎移植后诞生了小牛[12]。OPS冷冻法的冷却和升温速度可达20 000℃/min以上，接触冷冻保护剂的时间较短，减少了细胞毒性和渗透性伤害[11]。因此，OPS玻璃化技术为解决生殖低温生物学的基本问题提供了一条新途径，可能对动物生物技术和人类辅助生殖产生实际影响。

2.1.2 Solid surface（SSV）冷冻法 如图2所示，SSV法是将覆盖着铝箔的金属立方体部分浸入液氮中，使用移液管将含有胚胎的玻璃化液滴（约0.6 μL）置于金属立方体的表面，通过接触金属表面在-196℃下进行冷冻[13]。体外成熟的牛卵母细胞经SSV法冷冻后存活率和发育率较高[14]。SSV法具有商业优势，因为胚胎不会直接接触液氮，减少了玻璃化冷冻过程对胚胎的污染风险。

2.1.3 Cryotop 冷冻法 如图3所示，Cryotop法是将含有胚胎的玻璃化液滴（约0.1 µL）放在一个细的聚丙烯带（宽×长×厚=0.4 mm×20 mm×0.1 mm）上，立即垂直浸入到液氮中完成冷冻过程，最后将Cryotop板盖上塑料盖，储存在液氮中[15]。Do等[4]用该方法对牛胚胎冷冻保存，囊胚孵化率为90%，Cryotop法已经被证明是一种简单实用的玻璃化技术。

Cryotop法使用的玻璃化冷冻液体积最小，可增加冷冻（23 000℃/min）解冻速率(40 000℃/min)[16]，降低冷冻损伤。Kuwayama[16]认为，与任何其他玻璃化载体相比，使用Cryotop方法对囊胚的冷冻保存有更高的效率。

2.1.4 Cryoloop冷冻法 如图4所示，Cryoloop法是将一个尼龙环（20 mm宽；内径0.5～0.7 mm）安装在不锈钢细管上，另一端插在冷冻瓶的盖子上。玻璃化冷冻时，将囊胚放在涂有一层冷冻保护剂薄膜的尼龙环上，然后放入装有液氮的冷冻瓶中[17]。Lane等[18]用Cryoloop法冷冻牛胚胎，解冻后胚胎孵化率达到80%。Cryoloop法冷冻速率高达到700 000℃/min，可减少与冷冻保护剂接触的时间，减少了对细胞的毒性伤害。

2.1.5 微滴（Microdroplet）冷冻法 如图5所示，微滴玻璃化法是将含有胚胎的玻璃化冷冻液直接放入液氮中，消除了容器壁的绝缘效果[10]。在吸管尖端做一个含胚胎的1 µL的微滴，溶液凝固后将吸管尖端浸入液氮中，切去1 cm的尖端，平衡后30 s后将胚胎置于液氮中冷冻[19]。Yang等[20]用微滴法成功冷冻保存了牛胚胎。微滴法冷冻过程中胚胎与液氮直接接触，加快了冷却速率，同时也容易使胚胎污染。

2.1.6 Vitri-Inga冷冻法 如图6所示，Vitri-Inga是由一条薄的聚丙烯条带（0.7 mm厚）和一个特别设计的圆头组成的冷冻装置，圆头有一个小孔用来放置细胞，条带的另一端与塑料手柄相连。冷冻过程中，将卵母细胞/胚胎放在Vitri-Inga条带的孔中，然后立即浸入液氮中，冷冻速率为22 800℃/min[21]。Vitri-Inga是开放的冷冻装置，胚胎与液氮直接接触，容易受污染。

2.1.7 尼龙网（Nylon Mesh）冷冻法 如图7所示，尼龙网冷冻法是将尼龙网（60 µm网径）作为冷冻载体，将尼龙网剪成三角形，底高分别约1.0 cm和1.3 cm，用棉涤纶线（0.2 mm直径）与尼龙网连接。使用前，用高压锅对尼龙网格灭菌，用滤纸吸去尼龙网格上多余的玻璃化液。将冷冻液中的卵母细胞/胚胎吸出放到尼龙网上，在30～50 s内将尼龙网浸入装有液氮的手柄上的2 mL聚丙烯管中，放入液氮中储存[22]。尼龙网面积大，有利于冷冻细胞的恢复和减少细胞损伤。

2.1.8 纸容器（Paper Cryodevice）冷冻法 如图8所示，纸容器是从半透明图纸上剪下来的，其尺寸是可以装入冷冻管中以储存在液氮中。用移液管将胚胎放到纸容器尖端处，用镊子将纸容器插入液氮中，在将其插入液氮之前去除过量的玻璃化冷冻液，在液氮下将其转移到冷冻管中[23]。Kim等[24]首次使用纸容器对牛囊胚进行玻璃化冷冻，解冻后存活率高于95%，囊胚孵化率为73%，妊娠率为19.3%，产仔率12.3%。

纸容器玻璃化冷冻法操作简单，成本较低，纸容器可吸收多余的冷冻保护剂溶液，可以使卵母细胞或胚胎周围的玻璃化溶液的体积最小化，因此增加了冷冻和解冻速率，但是因为胚胎直接接触液氮，所以容易污染[24]。

2.1.9 Hollow Fiber（HFV）冷冻法 如图9所示，将一段25 mm长的中空纤维连接到注射针上，组成HFV装置。HFV装置与1 mL的注射器和吸管连接，将胚胎吸入中空纤维中。然后分离开Hollow fiber与注射针，用镊子将含胚胎的Hollow fiber依次放入平衡液和冷冻液，最后投入液氮。HFV冷冻液体积较小，且容纳的胚胎多[25]。Uchikura等[26]用Hollow fiber 法冷冻牛胚胎存活率为82.5%。

2.2 冷冻保护剂 冷冻保护剂被定义为能够减少或防止细胞冷冻损伤的试剂，主要分为渗透性保护剂、非渗透性保护剂和抗冻蛋白。

2.2.1 渗透性抗冻保护剂 渗透性保护剂分子量小，容易穿过细胞膜，可使胚胎内浓度达到玻璃化所需要的浓度，渗透性保护剂有乙二醇（EG）、二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇（PG）和甘油等。渗透性保护剂能够将细胞内水分吸出从而减少细胞内冰晶的形成，可用于早期胚胎冷冻，但是这类保护剂对细胞有一定的毒害作用。

EG是所有二元醇中最有效的冷冻保护剂，它具有低毒性和高膜渗透性，这种优势使其能够在室温下处理冷冻胚胎[27]。PG也有一定程度的防冻保护作用，通过固态CO2程序或液氮蒸汽在甘油中冷冻的方法胚胎的存活率相对较高，但存活率低于缓慢冷冻的胚胎[28]。

2.2.2 非渗透性抗冻保护剂 非渗透性冷冻保护剂是一些大分子物质，不容易穿过细胞膜，如聚乙二醇（PEG）、蔗糖、葡萄糖、海藻糖和半乳糖等，可用于囊胚冷冻。蔗糖几乎已经成为玻璃化冷冻保护液的主要成分，这类保护剂作用于细胞外，在低温下对胚胎没有毒性作用[29]。非渗透性保护剂的作用是增加溶液渗透压，避免细胞内冰晶的形成，减少渗透性冷冻保护剂引起的化学毒性，提高玻璃化后囊胚的存活率。

2.2.3 抗冻保护剂组合 将渗透性抗冻保护剂和非渗透性抗冻保护剂按照一定比例混合使用，可提高玻璃化冷冻效率。

EG毒性小且渗透性强，所以形成的玻璃化状态较差，DMSO与EG相比毒性较大且渗透性较差，但形成的玻璃化状态较好。玻璃化冷冻使用25% EG+25%DMSO组合可使冷冻胚胎有较高的解冻率（75%）和孵化率（70%），因此将EG与DMSO等量比例混合使用效果较好[29]。

2.2.4 抗冻蛋白 抗冻蛋白（AFPs）是一种能吸附到冰晶表面并阻止其生长的蛋白质，最早由Devriesde等[30]在海洋结冰地区的鱼血液中鉴定出来。自从发现第1个AFP以来，不仅在易结冰地区更广泛的鱼类中发现了具有这些特性的蛋白质，而且在许多植物和昆虫中也发现了具有这些特性的蛋白质。AFP能够稳定细胞膜，且可以与冰晶结合从而抑制冰晶生长和在冷冻液中的重结晶，进而保护细胞及其膜免受低温损伤，提高冷冻保存的成功率。

AFP通过保持细胞膜的完整性和细胞内ATP的含量，提高了小鼠胚胎的冷冻存活率和胚胎发育能力[31]。AFP可以保护冷冻牛卵母细胞的完整性，使其保持功能完整，对冷冻哺乳动物细胞的短期保存具有重要意义。

3 玻璃化冷冻牛胚胎应用情况

3.1 体内生产胚胎 目前，通过超数排卵和人工授精的方法获得的体内囊胚，胚胎质量最优，其冷冻效果也最好。研究表明，牛体内生产囊胚，采用玻璃化法冷冻后，存活率可达100%，扩张率可达90%以上，移植率可达50%以上[32]。

3.2 IVF胚胎 研究证实，与体内胚胎相比，体外受精（IVF）牛胚胎对冷冻损伤更敏感，尤其是对缓慢冷冻的敏感性更强，主要是因为体外培养会使其细胞质中脂类含量增加[33]。近年来，研究人员经过大量努力，取得了一定的研究进展。

牛IVF囊胚采用OPS玻璃化法冷冻时，解冻后囊胚存活率可达90.5%[34]、孵化率达94%[11]，冷冻囊胚移植后妊娠率可达50%[8,35]、产犊率达100%[8]。同时，当牛IVF囊胚采用Cryotop玻璃化法进行冷冻时，存活率可达100%[36]，扩张率为96%[4]，移植妊娠率为46.8%、产犊率为34.3%[37]。用自动玻璃化设备对牛IVF囊胚玻璃化冷冻时，存活率为100%，卵裂率为54%[38]。

采用CVM玻璃化冷冻法、以16.5% EG+16.5%DMSO+0.5 mol/L 蔗糖为冷冻保护剂冷冻牛IVF囊胚，囊胚存活率为94.5%，孵化率为53.6%[39]。Kim等[24]研究表明，采用电子网格、塑料吸管和纸容器玻璃化法冷冻IVF牛囊胚，囊胚存活率分别为88%、86.7%和94.7%，孵化率分别为64.7%、46.7%和73%[24]。

3.3 ICSI胚胎 胞浆内单精子注射（ICSI）是一种高效的辅助人和动物精子受精的治疗方法。研究表明，ICSI囊胚比IVF囊胚对玻璃化冷冻更敏感，而完全扩张的ICSI囊胚和IVF囊胚玻璃化冷冻后有相似的存活能力，因此ICSI囊胚玻璃化冷冻阶段在扩张囊胚为宜[40]。

Zhao等[41]用OPS冷冻法玻璃化冷冻牛ICSI胚胎，以15% EG+15% DMSO+0.3 mol/L蔗糖为冷冻保护剂，解冻后存活率为82.4%。Abdalla等[40]采用Cryotop冷冻法玻璃化冷冻第7天 ICSI 完全扩张囊胚，以15%EG+15% DMSO+0.5 mol/L蔗糖为冷冻保护剂，解冻后存活率为83%，孵化率为73%。

3.4 SCNT胚胎 近年来，体细胞核移植技术（SCNT）发展迅速，利用SCNT可以得到大量遗传资源优良的牛克隆胚胎。通常认为SCNT胚胎比IVF胚胎和体内产生的胚胎对冷冻损伤更敏感，这可能是由于在去核和细胞注射过程中由显微操作引起的透明带完整性丧失造成的。

采用OPS法玻璃化冷冻牛SCNT囊胚的研究中，以40% EG+30% 聚蔗糖+0.5 mol/L蔗糖为冷冻保护剂时第60天妊娠率为33.3%，产犊率为33.3%[42]；以20%+20% DMSO+0.6 mol/L蔗糖为冷冻保护剂时第40天时妊娠率为43%，产犊率为16.7%[43]。同时，牛SCNT囊胚采用Cryotop玻璃化法进行冷冻时，以15%+15% DMSO+0.5 mol/L蔗糖为冷冻保护剂时存活率为69.8%[44]，以20%+20% DMSO+0.5 mol/L蔗糖为冷冻保护剂时存活率达80%，移植后第40天妊娠率为50%[45]。

另外,Nguyen等[46]采用细管法、以EG+蔗糖+聚蔗糖为玻璃化冷冻液对SCNT胚胎进行冷冻，SCNT胚胎存活率高达93%、孵化率高达95%；Lonergan等[47]采用SSV玻璃化冷冻法、以EG和DMSO为抗冻保护剂，SCNT囊胚移植后第25天妊娠率达67.7%。

4 展 望

胚胎冷冻保存技术是辅助生殖的重要手段。慢速冷冻技术操作复杂、降温慢、耗时长，不适用胚胎冷冻。而玻璃化冷冻技术具有操作简单、成本低、效率高等优点，在生产上应用较多。随着玻璃化冷冻方法和冷冻保护剂的不断开发和优化，牛胚胎玻璃化冷冻技术的冷冻效率势必进一步提高，更加广泛应用于实践中，为胚胎的冷冻保存开辟了新的前景，推进了优良种质资源的利用和牛产业的健康发展。