牛奶的中红外光谱相关指标及遗传规律研究进展

娄文琦，罗汉鹏，刘 林，邹 杨，王雅春*

（1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.北京奶牛中心，北京 100192）

消费需求的改变导致乳品业越来越注重牛奶品质。选择作为物种起源与进化的动力和机制，对提升家畜生产力起极大作用，同时有效的表型分析工具和准确的表型测定是加快被选性状遗传进展的关键因素[1]。从群体水平上测定牛奶品质性状并将其作为目标性状加入育种计划，有利于提升牛奶品质，满足消费需求。这种对牛奶进行快速、廉价、准确、高通量分析的方法促使中红外（Mid-Infrared，MIR）光谱在畜牧业和食品领域大量应用。在MIR区域中，物质被电磁辐射穿过，分子键位因吸收能量而发生改变，根据被照射样品的能量吸收程度，结合光谱分析，可对样品进行定性和定量分析。中红外光谱分析技术(Mid-Infrared Spectroscopy，MIRS)作为潜在工具可用于大群的表型及遗传数据收集，正成为乳品科学的主要课题之一[2]。国内牛奶MIRS作为奶牛相关性状的研究和应用还未见报道，故本文总结了目前牛奶MIR光谱相关指标及其遗传规律，旨在深入认识MIR光谱的遗传特性，为通过牛群选育提高牛奶品质提供理论基础。

1 牛奶MIRS原理及数据处理

1.1 牛奶MIRS简介 早在1967年，红外分析方法便用于牛奶脂肪、蛋白、乳糖含量检测[3]。且随着MIRS相关硬件设施及精确测定方法的提升，乳品业从依据奶牛体脂率和体重评价牛奶价值体系转换为依据牛奶成分比重确定牛奶价值，这无疑推动了整个行业的发展[4]。随后MIRS迅速应用于奶酪制作及后续质量鉴定，在线实时估计牛奶凝乳参数，监控奶酪制作[5]。该项技术发展越来越成熟，逐步适用牛奶规模化质量检测，在此基础上出现了奶牛生产性能测定体系（Dairy Herd Improvement，DHI）。

传统乳制品检测分析速度慢，步骤繁琐，准确度不能保证，凯氏定氮法、分光光度计法、酸水解法等方法越显疲软。气相色谱法（Gas Chromatography，GC）、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）等测定方法准确可靠，但仪器设备要求高，限于实验室。越来越多研究表明使用MIRS不仅能对牛奶中常规营养成分（如蛋白质、脂肪、尿素含量、体细胞数等）进行测定，还能分析和预测经济相关的新牛奶表型（如各类脂肪酸、乳蛋白组成及结构、凝乳特性[6]、滴定酸度[7]、机体能量[8]、潜在疾病[9]等）。

致力于探究MIR光谱在乳业中应用于表型预测或遗传目的有效性研究逐渐增多，总体上呈上升趋势。关于预测牛奶中新性状的大型国际研究项目也印证了这一点[10]。

1.2 牛奶MIRS原理 红外光处在微波光区和可见光区之间，位于红光外侧，故命名为“红外线”。根据波长可分近红外光区(0.75～2.50 μm)、中红外光区(2.50～25.00 μm)、远红外光区(25.00～1 000.00 μm)3个区。不同波长的光具有不同作用，MIR是波数4 000～400 cm-1的电磁波，是绝大多数有机物和无机离子的基频吸收带，也是红外光中最适合进行物质定性和定量分析区域，主要应用于有机物结构的识别和鉴定[11]。

MIR光谱通常以波数来表示吸收谱带的位置，横轴单位为cm-1，是指1 cm长度内波的数目，纵轴单位为吸光度（Absorbance，A）或透过率（Transmittance，T），且T=10-A，而T=I牛奶/水，其中I为透射度，由于牛奶是混合物，所以一般T＜1。

如图1所示，化合物在此范围内呈基频、倍频或合频吸收，有特异的红外吸收峰，峰的位置、形状、数目和强度均随化合物不同而不同，因此像人的指纹一样具有特异性[12]，例如乳蛋白相关的光谱区域为1 604～1 000、3 040～1 701、4 000～3 460 cm-1[13-15]；乳脂相关光谱区域为1 805～1 736、3 000～2 800 cm-1[16-18]；与水相关的光谱区域为830～650、1 700～1 600、3 470～3 040 cm-1。借助已有信息（官能团等）对未知样的MIR光谱进行分析，可判定样品是否存在相关官能团，能较准确推断出该物质结构，从而定性分析化合物。乳成分浓度影响吸收峰强度，因此特征吸收峰值是分子量的函数，根据MIR光谱上特征吸收峰来建立预测模型并不断校正，便可实现对目标乳成分定量分析。

1.3 牛奶MIR光谱处理及标准方程建立 早在2006年，Soyeurt等[19-21]尝试对牛奶脂肪含量的MIR光谱建立标准预测方程，结果可行，并且这种预测存在潜在遗传价值，随后De Marchi等[18]、Ferrand等[22]、Ferrand-Calmels等[23]、Eijndhoven等[24-25]采用多种数据分析方法对MIR光谱进行探究以提高牛奶脂肪组分标准预测模型准确性。此外，Etzion等[14]、Marchi等[15]、Bonfatti等[26]研究表明MIR光谱可对牛奶蛋白质含量进行预测；Byler等[27]、Soyeurt等[28]、Wu等[29]、Santos等[30]、Toffanin等[7]利用MIR光谱对奶中矿物质及其他物质建立预测模型，具有较高预测和鉴定能力。

牛奶中微粒分布状态、分子互作、样品大小等因素会导致随机噪音、基线漂移等干扰信息出现，利用预处理可提高光谱数据与化学测定值之间的线性关系[31]。原始MIR光谱预处理方法主要包括多元散射校正（Multipli cative Scatter Correction，MSC）、正态化（Normalization）、标准正态变量变换（Standard Normal Variate，SNV）、求导算法（Derivative）、平滑处理（Smoothing）等。

Soyeurt[32]和De Marchi等[18]探究不同校正方法对牛奶脂肪组分估计准确性的影响，结果显示处理后数据比原始数据具有更好的准确性。MSC和平滑处理可有效消除样品自身对光谱的影响，提高信噪比。图2是原始MIR光谱经导数运算后峰值变化情况，降低光谱峰值偏移和漂移，提高分辨率，可有效挑选峰值。其他如标准正则变换能有效筛选相关光谱区域，减少无关或较弱相关区域干扰，归一化则可同时消除绝对强度及光散射的影响。最后使用偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）或其他方法进行回归拟合，在此基础上，可采用动物模型对目标性状进行遗传评估。

2 牛奶MIR光谱数据在国外的相关研究

2.1 牛奶MIR光谱遗传分析 牛奶MIR光谱是牛奶中物质与MIR相互作用的产物，吸光度或透射率与表型相关，这种关系导致可以利用不同标准方程预测相应乳成分，MIR光谱本身最能反映牛奶信息。Soyeurt等[33]对奶样MIR光谱上1 060个波数进行遗传参数估计，整体光谱数据的遗传力（h2）为0.003～0.42，1 678～1 616、3 668～3 066 cm-12个区域的遗传力接近于0，其中1 616～926、3 000～2 800 cm-12个光谱区域具有中高遗传力，与牛奶成分（乳脂、乳糖等）相关光谱区域遗传力h2与这些性状实际估计遗传力相当，说明牛奶MIR光谱本身具有遗传变异性。Bittante等[34]同样对5 000～930 cm-1的1 056个变量进行了遗传估计，168个变量的h2在0.05以下，578个变量的h2处在0.05～0.10，其平均透射率为0.94，有8个变量的h2大于0.25，确定了以透射率为单位的每个变量都能遗传，并且大部分h2高于0.10。

近年，Zaalberg等[35]比较丹麦荷斯坦牛（DH）以及娟姗牛（DJ）的MIR光谱数据（5 000～925 cm-1）遗传参数，发现DH、DJ的MIR光谱h2变化范围分别为0～0.31、0～0.30，且前者的h2和遗传相关都比后者高，其中与乳糖、乳蛋白相关的中红外区域最能体现品种差异。整个光谱的h2是适中的，并且不同波数之间具有强的遗传相关。

整体上MIR光谱是一条具有低中高遗传力的曲线，且与牛奶组分相对应，h2估计结果表明并非所有的MIR区域都具有遗传意义，需要开展更多关于光谱遗传变异的研究，减少未来用于遗传育种的光谱数据大小，筛选光谱区域选择的最佳方法和探究主成分的潜在作用。

2.2 乳脂的遗传分析 脂肪是牛奶重要的质量性状及感官性状，由甘油和多种脂肪酸（Fatty Acid，FA）组成，FA组分包括C4:0、C6:0、C14:0、C14:1、C16:0、C16:1、C18：0、C18:1、C18:2、SFA、MUFA、PUFA以及共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid，CLA）等，根据链长可分为长链脂肪酸（Long Chain Fatty Acid，LCFA）、中链脂肪酸（Middle Chain Fatty Acid，MCFA）、短链脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA）。牛奶中饱和脂肪酸（Saturated Fatty Acid，SFA）：单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）：多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA）比例一般为14:5:1[36]，与人体健康最佳吸收配比3:6:1相差甚远。FA组分含量的不同会影响所制作黄油、奶酪[37]的延展性，故对于牛奶中脂肪的遗传评估可确定育种目标，制定实际育种计划。

2007年，Soyeurt等[38]率先对MIR光谱预测的FA组分进行遗传估计，牛奶中大多FA遗传力h2为0.19～0.38，乳脂中FA的h2为0.15～0.28，C12:0、C16:0、C18:0与乳脂率（Fat Percentage，FP）有强遗传相关，C14:0与FP的遗传相关接近0（-0.06），所预测牛奶中FA存在遗传变异；在此基础上，Soyeurt[39]使用更为准确MIR光谱预测模型结合贝叶斯算法，性状总体上呈中高遗传力，与前人[38]研究相比有所提高，这与预测模型和遗传估计方法有关。

此外，预测的FA在不同的泌乳天数、碳链长度以及品种间均存在差异。Soyeurt等[39]研究表明，牛奶中乳脂、蛋白质、SAT含量的h2随泌乳天数呈先上升后下降趋势。Fleming等[40]结果显示，乳脂量与LCFA、UNSAT的遗传相关随着泌乳天数增加而降低，与SCFA的遗传相关随之升高，并且泌乳早期LCFA和UNSAT具有更强遗传相关，这可能受奶牛能量平衡影响，不同FA与产奶量、乳蛋白量、体细胞分之间的遗传相关分别为-0.62～-0.59、-0.32～-0.25、0.25～0.36，因此现 有对产奶性状进行的选择，将会导致牛奶中FA组成发生改变。Narayana等[41]表示，中链（11～16个碳）组的h2（0.32）高于短链（4～10个碳）组（0.24）和长链（17～22个碳）组（0.23），SAT的h2（0.33）高于UNSAT（0.21）。如表1所示，预测FA遗传力总体上随碳链长度变化大致呈先上升后下降趋势，表明体内合成脂肪酸比已有脂肪酸更具基因调控性，不同链长和饱和度的FA遗传相关又说明了起源和组别的相似性与差异性。Hein等[42]还比较了丹麦地区荷斯坦牛（DH）与娟姗牛（DJ），结果显示前者SAT和UNSAT的h2高达0.15，2个群体中SCFA、C16:0 的h2相似，MUFA、PUFA、单链脂肪酸和C16:0的遗传相关在2个群体中有很大差异。

Bastin等[43]指出，泌乳早期中UNSFA、MUFA、LCFA、C18:0、C18:1（顺-9）与空怀天数（Days Open，DOPN）存在正遗传相关，100 d后呈负遗传相关，其他FA与DOPN呈负遗传相关，说明牛奶FA含量可以作为繁殖性状判断的潜在指标。Toledo-Alvarado等[44]研究表明，通过MIRS检测奶样FA变化可以辅助诊断奶牛发情。也有研究表明FA与奶牛甲烷产量有明显遗传相关[45]。

从表1中可得，MIR光谱预测的总乳脂或FA具有遗传变异性，进行遗传选择是可行的，总体上呈中高遗传力，且现用于建立预测方程样本数越来越大，方程准确性不断提高。此外，可对相关性状进行间接遗传选择。对牛奶不同FA进行研究，有望通过基因选择改变脂肪组成，提高牛奶的营养和经济价值。

表1 牛奶脂肪酸MIR光谱预测值遗传力（遗传力±标准误%）

2.3 乳蛋白遗传分析 乳蛋白可分为酪蛋白（80%）和乳清蛋白（20%），含人体生长发育的一切必需氨基酸和其他氨基酸。通过MIR光谱预测乳蛋白并进行遗传估计，总体上乳蛋白率的h2比乳蛋白含量要高。Fleming等[46]研究显示，MIR光谱预测的乳蛋白率的h2为0.36。αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白的h2为0.25～0.72，β-乳清蛋白的h2较高，为0.61～0.86[47]。

乳蛋白组成会影响奶酪产量和特性，在不同奶酪制作中扮演重要角色[48-50]，对生产具有重大意义。值得一提的是，乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）具有抗细菌、真菌、病毒的功能[51-52]。Soyeurt等[53]对奶中LF含量进行预测，得到新性状乳铁蛋白预测值（Prediction Lactoferrin，pLF），经分析pLF 遗传力h2为0.197，与SCC遗传相关为0.04，pLF作为乳房炎预测指标的潜力有待挖掘。Arnould等[54]表示，pLF 的h2为0.22，pLF和产奶量、乳蛋白率、乳脂率、体细胞分的遗传相关分别为-0.25、0.52、0.37、0.24，LF可能是反映乳房炎的潜在指标。但需对LF进行遗传选择与提升乳房炎抗性的关系进一步研究。

Bonfatti等[26]研究发现，MIR光谱不能准确地预测牛奶中单一蛋白，但预测值可以作为一种用于选择育种中提高牛奶蛋白的潜在指标。借助MIRS探究乳蛋白新表型，其蛋白组分MIR光谱预测值与测定值之间的遗传相关有待研究，这将会影响到预测值作为选择育种指标的可行性。

2.4 牛奶中钙、磷及β-羟基丁酸、乳脂滴的遗传分析矿物质是动物体内一类无机营养物，人体中存有60余种，不同元素具有不同生理功能，在动物正常生长、生产、繁殖等活动中不可或缺，摄取不足或过量会造成机能障碍。牛奶作为富含有机钙的营养饮品，Caroli等[55]特别强调了奶中钙及其他元素的重要性。此外，奶中钙、磷会影响凝乳特性及其均匀性[56-57]。Toffanin等[58]研究显示，钙、磷、可滴定酸度的预测值h2分别为0.1、0.12、0.26，它们之间的表型相关性和遗传相关分别为0.33～0.82、0.28～0.92，但它们与牛奶质量和产量之间的表型相关为0～0.45，与乳脂率、乳蛋白率的遗传相关为0.35～0.91。可遗传的变异加上常规可用的MIRS预测这些牛奶特征表明，这些成分的遗传选择是可能的。

Belay等[59]在牛奶MIR光谱基础上对血中β-羟基丁酸（BHB）进行预测，并估计预测值h2为0.250～0.365，BHB与能量负平衡有关，借助MIRS为选育提供一种新途径，以降低奶牛对酮病的敏感性。由于乳脂滴（Milk Fat Globule，MFG）会影响加工和感官特性，Fleming等[46]利用MIR光谱预测MFG大小并进行遗传估计，其体积、表面积遗传力分别为0.30、0.239，两者与乳脂率的遗传相关大于0.97。由此可见，一些新型经济性状借助MIRS被逐渐挖掘。

3 牛奶的MIRS在国内的相关研究报道

随着计算机以及化学技术的提升，MIR也开始应用于食品行业。杭州、上海、西安从20世纪90年代开始DHI测定，并且到目前为止所用的机械设备都是从国外购入，国内未有自主研发成果，不了解核心分析技术导致牛奶相关指标遗传研究难度较大。

2011年，杨仁杰等[60]利用MIRS对牛奶中尿素进行检测，找到了尿素浓度与光谱中2个吸收峰之间的拟合曲线方程，相关系数大于0.80。2012年，赵秀琴[61]对中红外研究仪器发展历程进行概括。张文海等[62]指出只有通过提高模型的稳定性以及模型传递的研究，才能使得这项技术能更好的应用于实际生产中。2014年，李巧玲等[63]通过检测牛奶中不同含量的非蛋白氮（尿素、三聚氰胺），结合其他方法，找出掺假物质的特征峰所在波数与对应吸光度或峰值规律，结果表明可以对牛奶是否掺入非蛋白氮类物质进行定性和定量分析。2016年，董利锋等[11]总结了MIRS对牛奶中组分指标进行定量分析的基本流程，首先需测定校正集样本的MIR数据及化学准确值，接着对数据进行预处理后拟合，最后利用验证集样本数据验证拟合模型的准确度，择优选择。2019年，阮健等[64]对常用于牛奶及奶产品中成分定量回归建模的方法及其特征进行总结，如神经元拟合PLS、非线性迭代PLS、BP人工神经网络等，具有参考价值。综上表明我国科研人员对MIRS及MIR数据的重视程度逐渐提高。

4 前景和展望

MIRS广泛用于多个领域，它不需对所采样品进行太多预处理就可直接进行分析，借助定制化、简化的仪器能对不同领域的待检产品进行在线大批量连续测定，自动地快速获得无损光谱，成本低。光谱包含了非常复杂的信息，对每个样本的描述是独一无二，反映了其物理和分子特性。现许多研究围绕如何利用牛奶MIRS数据进行分析，对牛奶中具有经济价值且测量成本高的新性状的相关光谱区域进行建模，并利用化学计量法得到准确值对该模型不断校正，应用于生产中。作为育种工作者自然关注牛奶MIRS数据及所预测的新性状遗传指标，从而出现有关脂肪酸、酪蛋白、乳铁蛋白、酮体、凝乳特性、矿物质、可滴定酸度等新经济指标的遗传研究。但同时存在很多问题，例如中国MIR数据如何进行大规模完整的收集，如何对收集好的数据进行恰当分析，并且还需更多研究对中红外光谱中出现的中高遗传变异做出解释。

借助DHI的乳脂率、乳蛋白率、产奶量等信息对奶牛进行选择已经很多年，MIRS作为研究新的与经济相关牛奶性状的桥梁值得关注，寻找MIR光谱中与性状有关波数以及数据处理和建模方法是现在的难题。相比于国外，中国缺乏有效的MIRS数据收集、整理、储存、分析等手段，缺乏适宜的应用模型，这方面的研究几乎空白，应予以高度关注，以促进我国牛奶质量上升，满足消费需求，振兴乳业发展。