猪精液常温保存抗氧化剂研究进展

曾 耀，孙琳琳，吴 德，曾文先*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.四川农业大学动物营养研究所，四川雅安 625014）

随着可持续发展战略的实施以及现代化养殖业的发展，规模化、集约化成为养猪行业的整体趋势。在此趋势下，猪人工授精技术显得尤为重要。如何使母猪在人工授精后获得理想的受胎率和产仔数是稀释液研究的目标，需要深入了解猪精子的生物学结构。猪精子对冷应激的敏感性决定了目前常温保存为猪精液的主要保存方式[1]。常温保存过程中活性氧（ROS）自由基的大量累积会破坏精子质膜、线粒体、DNA等，从而导致人工授精效率的降低。在常温保存稀释液中添加适量抗氧化剂有助于维持猪精子的结构与功能，维持精子的正常品质。某些抗氧化剂在抗氧化的同时，还通过其他途径保护精子。本文对猪精子的生物学特征、常温保存过程中猪精液累积活性氧的原因以及常温保存中抗氧化剂的研究进展加以综述，以期为猪精液的保存和提高人工授精后母猪的生产性能作为参考。

1 猪精子生物学特征

1.1 猪精子主要结构 猪精子由头、颈、尾三部分构成，头部呈扁卵圆形，主要由高度浓缩的细胞核和位于头部前端的顶体组成。精子顶体是一个双层膜组成的帽状结构，顶体内含有多种酶。精子的颈部位于头尾之间，呈圆柱状。精子的尾部可以分为中段、主段和末段3个部分，其内部含有轴丝。中段的轴丝被外部致密纤维和线粒体鞘包围，主段部分的轴丝外围绕着纤维鞘。纤维鞘向末段逐渐延伸并变薄，并在末端起始的地方消失。精子尾部内的轴丝由位于中心的2根单独的微管和围绕它的9对双联微管以及数百个辅助蛋白组成[2]（图1）。

1.2 猪精子质膜特殊性 哺乳动物精子细胞膜的膜脂质主要是由磷脂、胆固醇和少量糖脂构成。磷脂和胆固醇对于精子维持膜系统结构完整性十分重要。当猪精子遭受冷应激时，膜磷脂经历一个相变过程，从一个以磷脂高旋转及横向流动性为特征的液晶相转变为脂质移动受限的晶体凝胶相。胆固醇能使膜在低温下更具流动性，从而降低对冷应激的敏感性。然而精子胆固醇/磷脂的比值在哺乳动物中有所不同：人类为0.99，兔子为0.88，山羊为0.58，公牛为0.45，公羊为0.37，公猪为0.35[3]。相比之下，公猪精子胆固醇/磷脂的比值很低，这导致公猪精子对冷应激十分敏感[4]。猪精子的细胞膜脂质中不饱和脂肪酸含量较高，容易受到ROS自由基的攻击。

1.3 猪精子线粒体 线粒体是细胞进行氧化磷酸化产生ATP的主要场所，可将其划分为线粒体内膜、线粒体外膜、线粒体基质和内外膜间隙4部分。哺乳动物精子在发生过程中，一些线粒体会丢失，剩余的72～80个线粒体围绕中段轴丝螺旋形成线粒体鞘[5]。

线粒体内膜向内凹陷形成嵴，上面有构成电子传递链（ETC）的复合物Ⅰ-Ⅳ、ATP合成酶（复合物Ⅴ），它们能够传递从NADH和FADH2携带的电子，最终将电子转移给O2，使其还原成水。在此过程中，复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ将线粒体基质中的H+转移到内外膜间隙中，产生质子梯度，随后ATP合成酶利用此化学梯度将ADP合成ATP。其中质子梯度被称之为线粒体膜电位（MMP）。线粒体是ROS自由基的主要产生部位，ETC在传递电子产生ATP的过程中，会有电子从复合物Ⅰ和Ⅲ逃逸并结合O2生成超氧阴离子（·O2-）[6-7]。正常情况下，进行氧化磷酸化氧气的1%～2%会得电子变为·O2-，·O2-可以被视为大多数ROS的前体。

精子线粒体含有自己母系遗传基因组，即线粒体DNA（mtDNA），它编码13种多肽，22种tRNAs和2种rRNAs。多肽是合成线粒体ETC复合物的必需亚基，而tRNAs和rRNAs对于多肽的翻译是必须的。Wei等[8]在HeLa细胞中发现随着线粒体活性和ATP水平的增加，线粒体DNA的转录和翻译进程被激活。Zhu等[9]发现低葡萄糖浓度能够激活猪精子线粒体DNA的转录与翻译，增强线粒体活性，增加线粒体ATP产量。

1.4 猪精子能量代谢 哺乳动物精子利用三磷酸腺苷（ATP）来维持细胞内环境，完成包括运动、获能、超活化和顶体反应等生理过程，这些过程所需要的ATP主要通过线粒体氧化磷酸化和糖酵解产生。精子线粒体全部位于尾部中段线粒体鞘中，与糖酵解相关的酶则定位于精子头和尾。研究发现，对于精子超活化、顶体反应、透明带结合等进程需要的是糖酵解而非线粒体的氧化磷酸化[10]。

在猪精子能量代谢的研究中，Marin等[11]通过代谢组学发现糖酵解是猪精子的重要供能方式。Guo等[12]用线粒体复合物Ⅰ抑制剂鱼滕酮以及氧化磷酸化抑制剂FCCP抑制公猪氧化磷酸化后，发现公猪精子运动显著下降，表明氧化磷酸化在公猪精子运动中起到了重要作用。Zhu等[9]研究发现，公猪精子用鱼滕酮抑制线粒体复合物Ⅰ后，线粒体膜电位、ATP含量降低，精子活力、直线速率降低。由此可见，对于猪精子而言，依靠线粒体的氧化磷酸化以及糖酵解都是不可或缺的。猪精子能量代谢与精子运动模式直接相关[9]。

2 ROS对猪精子的危害

猪精液常温保存期间，精子ROS自由基逐渐累积。Wang等[13]将猪精液常温保存5 d后发现，高ROS含量的精子占比随保存时间的延长逐渐增加（1 d：9.67%，3 d：14.01%，5 d：23.55%）。

2.1 精液内活性氧来源 ROS是正常生理过程和细胞代谢的产物，主要包括·O2-、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）。精液当中的ROS可以从3个方面产生。第一，线粒体ETC中的复合物Ⅰ和Ⅲ会泄漏电子，将O2还原成·O2-，·O2-自发的或在超氧化物歧化酶（SOD）的作用下歧化成H2O2，·O2-存在时间极短而且不能自由穿过细胞膜，但H2O2可以自由穿过细胞膜并且更稳定，与大多数细胞分子反应[14-15]。第二，精液中的白细胞以及头部发育异常的精子会产生过量的ROS。生殖道炎症等会导致精液中携带大量白细胞，特别是中性粒细胞和巨噬细胞，其中激活的中性粒细胞会在NADPH氧化酶（NOX）作用下，氧化NADPH产生大量的ROS[16-17]。Musset等[18]研究发现，人精子中存在NOX5，会氧化NADPH产生ROS。而在头部发育异常的精子中含有大量未排掉的细胞质，不乏大量葡萄糖6-磷酸脱氢酶，后者在磷酸戊糖途径下会产生NADPH，这可能会导致在NOX存在情况下产生大量的ROS[19]。第三，猪精液中的细菌也会产生ROS。

2.2 活性氧对精子的损伤 ROS会攻击质膜上的不饱和脂肪酸，夺取不饱和脂肪酸上的电子，使其成为脂质自由基（LH·），随后LH·会攻击相邻的不饱和脂肪酸，发生链式反应，造成脂质过氧化。脂质过氧化不仅导致膜流动性和功能的丧失，脂质过氧化的产物丙二醛（MDA）、4-羟基壬烯酸（4-HNE）也会造成精子DNA的损伤。另一方面，ROS自身会对精子线粒体DNA和核DNA造成损伤。ROS会攻击DNA碱基（尤其是鸟嘌呤）和磷酸二酯骨架，破坏DNA分子的稳定性，最终导致DNA片段化[20]。

但ROS并非是完全无益的。越来越多的证据表明，低水平的ROS对精子获能、超活化、顶体反应、趋化过程和精卵结合起到至关重要的作用[21-22]。

2.3 氧化平衡与氧化应激 精子细胞内含有多种抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、过氧化物酶（PRDXs）等。SOD能催化·O2-生成H2O2，后者在CAT的催化下生成H2O，GPX可以催化还原型谷胱甘肽（GSH）还原H2O2，生成H2O和氧化型谷胱甘肽（GS-SG）。GST可以将GSH与氧化物质以及有毒物质结合起到保护作用，PRDXs可将H2O2还原成H2O。

正常生理条件下，精子处于ROS产生与消耗的平衡中，该平衡一旦破坏便会使猪精子遭受氧化应激。在完成人工授精之前，猪精液需要经历采精、保存、运输等过程。种公猪生殖系统的炎症将会为精液带来大量的ROS，不规范的采精过程造成的细菌污染也会产生ROS。此外，运输过程中若猪精子遭遇冷应激，猪精子质膜胆固醇/磷脂比低的特殊性会造成胞膜及线粒体膜的损伤，线粒体结构的不完整会造成电子泄漏继而引发大量ROS的产生。在保存过程中、精子细胞质较少及精液被稀释的情况下，本身抗氧化物酶含量较少，在保存过程中会逐渐消耗。以上各种因素均会导致猪精子ROS产生-消除平衡的打破。因此，在猪精液稀释液中添加抗氧化物质的作用不言而喻。

3 常温保存中抗氧化剂研究进展

3.1 酶类抗氧化剂 SOD是精子内主要的抗氧化物酶之一。Vallorani等[23]对性别分选后的猪精子在15℃下保存24 h，发现添加375 IU/mL SOD和1%精浆的AndrohepTM®稀释液的处理组活率显著高于对照组。朱林炜等[24]研究发现，与100 IU/mL SOD组、400 IU/mL SOD相比，在Modena中添加200 IU/mL SOD、BTS中添加300 IU/mL SOD可以显著提高猪精子常温保存的活力，降低精液中MDA及H2O2的水平。Zhang等[25]在Modena中添加不同浓度的SOD对猪精子进行常温保存，发现添加200 IU/mL SOD可以显著提高猪精子的品质（活力、质膜、顶体完整性），有效存活时间延长至5 d，显著降低了猪精液中MDA和H2O2含量。

在精子当中，GPX和CAT共同将H2O2还原为H2O。Barranco等[26]在公猪生殖道（睾丸、附睾、附睾尾、精囊、前列腺、尿道球腺）中发现GPX5的表达，将猪精液常温保存至3 d后，精浆中GPX5高含量组（20.74～30.14 ng/mL）中精子的总活力显著高于GPX5低含量组（9.64～20.04 ng/mL），而且对于人工授精来说，GPX5高含量组人工授精后，母猪具有更高的分娩率和产仔数。

向稀释液中添加适量的SOD及GPX能够有效地保持猪精液在体外保存的品质，提高保存时间。目前在猪精子常温保存中添加CAT、PRDXs鲜有报道。

3.2 非酶类抗氧化剂

3.2.1 氨基酸及多肽类 GSH与谷胱甘肽氧化酶、GR、GS-SG形成“GSH/GS-SG氧化还原循环”，维持细胞内氧化还原稳态。即H2O2会被GSH还原成H2O，GSH在此过程中被氧化成GS-SG，GS-SG又被GR还原为GSH。Zhang等[27]研究发现，在Modena中添加GSH可以显著提高常温保存至第5天的猪精子品质，其中添加1 mmol/L GSH可以显著提高精子的活率及活力，添加1、5、10 mmol/L GSH可以显提高质膜完整性、顶体完整性及总抗氧化能力，添加1、5 mmol/L GSH可以显著降低精液中的MDA含量。

牛磺酸（Taurine）主要是通过2种方式抗氧化：作为直接抗氧化剂和增加抗氧化物酶活性。一方面，牛磺酸可以通过髓过氧化物酶（MPO）通路，将次氯酸（HOCl）转化为更低毒性的牛磺酸氯胺（Tau-Cl）。另一方面，牛磺酸可以作为线粒体蛋白质合成的调节剂保护线粒体免受活性氧伤害。Li等[28]研究发现，在Modena中添加5 mmol/L牛磺酸，常温保存猪精子至第5天后能显著提高猪精子的品质。谢东淇等[29]研究发现，在Modena中添加5 mmol/L牛磺酸和抗生素复合剂后，常温保存至第5天后，猪精子品质显著高于对照组。

谷氨酰胺（Gln）是合成GSH的前体物质，可以与半胱氨酸、甘氨酸共同合成谷胱甘肽。Wang等[13]发现，20 mmol/L的谷氨酰胺可以显著提高常温保存猪精子的品质（活力，质膜、顶体完整性），同时发现加入谷氨酰胺能够显著降低ROS含量并且显著提高GSH/GS-SG的比例和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）的活性。

3.2.2 多酚类 茶多酚（TPP）是茶叶中提取的一种天然多酚物质，主要成分为儿茶素。其本身具有抗氧化性。谢东淇[30]探究发现常温保存至4～6 d时，添加0.04 g/L TPP可以显著提高猪精子的品质（活率，顶体、质膜完整性），可以显著降低精液中的MDA含量，提高猪精子的总抗氧化能力。

白藜芦醇（Res）是一种主要存在于葡萄、桑葚中的多酚化合物。白藜芦醇具有抗氧化、抗癌、抗菌等生物学性能。范晓腾[31]研究发现，50 μmol/L的白藜芦醇可以显著提高常温保存猪精子的品质（活力，质膜、顶体完整性），线粒体活性，显著降低精液中的ROS含量。进一步研究发现150 μmol/L的白藜芦醇可以显著提高冷应激后猪精子的品质。在人工授精之前，猪精液运输过程不可避免，冬春季节运输过程中精液可能会遭受冷温打击，导致细胞质膜和顶体受损而降低母猪受胎率及产仔数。该研究可以为高寒地区及冬春季节猪精液的常温保存提供参考。

南非博士茶（Rooibos &Aspalatus linearis）存在于南非特有的灌木中，含有多酚物质。因其抗氧化和药用特性被广泛作为健康饮料。Ros-Santaella等[32]研究发现，添加南非博士茶提取物后，猪精子可以常温保存至4 d，且提取物浓度在0.002%～0.05% M/V（南非博士茶重量/100 mL水）时，与对照组相比添加提取物的处理组精子活力、质膜完整性、顶体完整性均有提高。

安石榴甙是从石榴皮中提取的多酚物质，具有良好的抗氧化性。安石榴甙能够清除包括·O2-、·OH在内的多种自由基，还能够提高抗氧化物酶（GPX、SOD等）的活性。郝哲[33]在BTS中添加15 μmol/L安石榴甙常温保存猪精子后，发现其能够显著提高猪精子的品质（活力，质膜、顶体完整率）、总抗氧化能力，显著降低猪精液的MDA，且10～20 μmol/L安石榴甙均能显著降低精液ROS水平。

3.2.3 维生素类 维生素E为脂溶性维生素，其水解产物为α-生育酚。它可以破坏ROS与膜脂质内脂肪酸侧链之间形成的共价键链接，是抵抗ROS造成脂质过氧化的主要膜保护剂之一。Zakošek等[34]研究发现，添加200 μmol/L维生素E有助于猪精液常温保存过程中猪精子的质膜完整，有助于猪精液维持较低的ROS水平。马红等[35]研究发现，25 mmol/L 维生素E组常温保存的民猪精子活率和质膜完整性显著高于对照组。

维生素C，又称抗坏血酸。马红等[35]研究发现，对于民猪精液常温保存，添加30 mmol/L 维生素C组的活率和质膜完整性显著高于对照组，但其效果弱于25 mmol/L 维生素E。

D-异抗坏血酸钠，又名异维生素C钠，是一种水溶性抗氧化剂。它的分子结构易于脱氢，容易与ROS发生反应。邓昌海[36]研究发现，当D-异抗坏血酸钠浓度为 0.006 mg/mL 时，猪精子品质（活率，质膜、顶体完整率）显著高于对照组，猪精液有效保存时间延长至5 d，且猪精液总抗氧化能力显著高于对照组，MDA、ROS水平显著低于对照组，表明D-异抗坏血酸钠对猪精子常温保存有显著效果。

维生素B12，又称钴胺素。存在于肉类中，促进蛋白质的生物合成。2018年，马红等[35]发现，对于民猪精液常温保存，添加45 mmol/L维生素B12组的活率和质膜完整性显著高于对照组，但其效果弱于25 mmol/L维生素E。

3.2.4 生物类黄酮 原花青素（OPC）常存在于黑枸杞、葡萄籽中，是天然的超强抗氧化物，属于生物类黄酮。刘斌[37]在稀释液中添加不同浓度OPC后常温保存猪精子，发现常温保存至5 d时，50 μg/mL OPC显著提高猪精子品质（活力，质膜、顶体完整率），并且随着OPC添加浓度的升高，猪精液中ROS和MDA呈剂量依赖式降低。胡亚美等[38]研究发现，向BTS中添加OPC常温保存猪精子5 d时，50 μg/mL OPC显著提高猪精子品质（活力，质膜、顶体完整率），且猪精液中的MDA呈剂量依赖式降低，精液的总抗氧化能力呈剂量依赖式升高。Li等[39]也得出相似结论。

淫羊藿苷（Icariin）是淫羊藿中含量最丰富的成分，属于类黄酮。侯震坤[40]研究发现，向BTS中加入15 mg/L淫羊藿苷能够显著提高保存至第5天猪精子的品质（活力，活率，质膜、顶体完整性），并且15 mg/L 淫羊藿苷处理组中ROS、MDA含量显著低于对照组，总抗氧化能力、SOD活性显著高于对照组。

水飞蓟素（SMN）是从植物水飞蓟种子提取出来的黄酮木脂素类化合物。水飞蓟素具有良好的抗氧化性，它可以优化线粒体电子传递链，减少电子泄露，阻止线粒体发生功能性障碍。汪顺伟[41]向Modena中添加SMN对猪精液进行常温保存，发现常温保存至5 d时，添加25 μmol/L处理组中的精子品质（活力，顶体、质膜完整性）、线粒体活性及总抗氧化能力显著高于对照组。

3.2.5 类胡萝卜素 虾青素（astaxanthin）广泛存在于生物界，属于类胡萝卜素。胡亚美[42]研究发现，添加了0.25 μg/mL虾青素的BTS有助于猪精子的常温保存，常温保存至5 d时，0.25 µg/mL虾青素处理组能显著提高猪精子品质（活力，质膜、顶体完整率），SOD、GPX、CAT的活性；添加1.00 μg/mL虾青素时，猪精液中MDA、ROS显著低于对照组，总抗氧化能力显著高于对照组。

3.2.6 胺类激素 褪黑素（MLT）是由哺乳动物和人类松果体产生的一种胺类激素，具有抗氧化等多种生理功能。许春荣等[43]研究发现，添加0.01 mmol/L MLT处理组的猪精子总存活时间显著高于对照组。

3.2.7 真菌代谢物 曲酸（Kojic acid）为几种真菌代谢物，具有很强的抗氧化物活性。侯震坤等[44]研究发现，常温保存至5 d时，添加0.04 g/L曲酸处理组可以显著提高猪精子的品质（活率，质膜、顶体完整性），同时也显著提高了猪精液总抗氧化能力。

常温保存过程中，细菌会对猪精子造成不可逆的损伤，在已有的探究中不少学者发现有些抗氧化剂本身带有一定的抗菌性，如淫羊藿苷[40]、茶多酚[30]、安石榴甙[33]等。这些物质大部分为中草药提取物，加之其没有抗生素滥用导致的耐药性等问题；为了维持精子在体外保存下正常的生理功能，能量的供应必不可少，猪精子运动依赖于线粒体氧化磷酸化和糖酵解的共同作用。对虾青素[42]、安石榴甙[33]等抗氧化剂研究中，学者们发现这些抗氧化剂可以调节猪精子的能量代谢，从能量代谢的角度提供了新的视野（表1）。

表1 猪精液常温保存非酶类抗氧化剂

4 总结与展望

维持猪精液体外保存的品质需要从多方面考虑：猪精子质膜特殊性决定了其对氧化应激及冷应激的敏感性；猪精子的能量供应由糖酵解及氧化磷酸化共同承担；猪精子自身及猪精液中白细胞、畸形精子、细菌等在精液体外保存过程中会产生活性氧并危害精子；猪精子及精浆中含有的抗氧化物质能在一定程度上维持精液的氧化稳态，但长时间的保存下猪精子仍然会遭受氧化应激；在稀释液中添加抗氧化物质能够有效地保持猪精子的品质，提高母猪的受胎率及产仔数。目前对于猪精液常温保存稀释液的研究尚不完善，对稀释液中添加物质需考虑如何维持精子内部自身的氧化还原稳态，提高精子内部抗氧化能力。某些植物提取类抗氧化物质能够额外起到包括抗冷应激、抗菌、促进能量代谢等功能，此类抗氧化物质值得进一步研究。