帕瑞昔布对骨关节炎大鼠软骨细胞的影响*

李 刚， 籍胤玺， 高 毅， 冯彦冰

(南阳市中心医院骨科， 河南 南阳 473000)

骨关节炎(osteoarthritis，OA) 是骨科疾病的一种，随着年龄的增长，患病人数不断增加，该病在中老年人群中出现概率较大[1]。骨关节炎主要因局部灶软骨的退行性变使软骨及关节周围肌肉损害而引起的进展性关节疾病[2-3]。骨关节炎的发病机理是：关节内部的软骨组织出现病变，导致关节软骨局部结构性破坏及病变[4]，前期表现不是十分明显，主要症状为关节内部病变、持续钝痛等。骨关节炎主要在人的手关节、膝关节等部位发病，主要表现为行动不便、肿胀等[5-6]。发病原因有多种因素，其中包括年龄、性别等。随着病情的发展，逐渐会出现病变关节的夜间休息痛，半月板损伤等，由于疼痛，关节的正常活动会受到限制[7]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)等炎性因子主要由T 细胞等免疫细胞产生，主要来源于患病机体中的关节软骨细胞，参与骨关节炎的发生与发展[8]。帕瑞昔布是一种环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)特异性抑制剂，属于抗关节炎药中的昔布类镇痛药。本文探讨帕瑞昔布对骨关节炎大鼠软骨细胞的影响及TNF-α/NF-κB在其中的作用，为临床应用提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

在广东省医学SD大鼠中心购买15只雄性SD大鼠，体重231～289 g，鼠龄接近。

1.2 模型制备与分组

将所选取的大鼠随机分组，第一组，模型组(MO组)：该组大鼠制作骨关节炎大鼠模型；第二组，假手术组(SS组)：该组大鼠在骨关节做切口后不做任何处理；第三组，治疗组(TR组)：该组大鼠制作骨关节炎模型后给予帕瑞昔布进行治疗，每组5只。

分别给予MO组、TR组大鼠骨关节注射木瓜蛋白酶溶液，剂量为0.15 ml，浓度为4%，3天一次，连续3次，制备骨关节炎模型。同时，给予SS组大鼠0.15 ml生理盐水。造模成功依据标准确定[9]，7 d后，给予TR组大鼠40 mg帕瑞昔布与生理盐水的混合液进行治疗，每两周1次，通过关节腔内注射的方式，MO组、SS组大鼠给予等体积的生理盐水，持续治疗1个月。在此期间，所有大鼠在相同环境下生活。实验完成后，将三组大鼠分别杀死并选取关节软骨组织，检测病变程度，再常规制成软骨细胞并进行保存，用于后续实验。

1.3 仪器与试剂

CCK-8试剂盒购自美仑生物公司(大连)；全自动生化仪购自格利特科技公司(济南)。

1.4 cck-8法对大鼠软骨细胞增殖数量进行检测

取出软骨细胞，稀释为1×105cells/ml，培养12 h。取培养好的软骨细胞平铺到16孔板中，并培养。培养到一定数量后，加入CCK-8 10 μl。常温放置30 min，利用读板器检测450 nm光密度值(OD值)。

1.5 HE染色法检测大鼠软骨组织病变程度

取三组大鼠软骨组织,固定15 min, 石蜡包埋, 5 μm切片,用山羊血清进行封闭处理,苏木精染色液复染分别为6～8 min, 观察软骨组织形态。

1.6 软骨病变程度判定标准

采用OARSI评分[10]对大鼠软骨病变程度进行判定。0分：软骨表面光滑无明显炎症，0～2分：可见明显水肿或纤维变性，表面出现磨损情况，2～4分：软骨浅层区域脱层，出现溃疡，4～6：关节表面外形变性，关节边缘骨赘形成。

1.7 Western blot法检测大鼠软骨细胞中TNF-α/NF-κB的蛋白表达量

取软骨细胞50 μg，洗净烘干电泳槽及其它部件，制备12%分离胶，制作1 cm的水层。将电泳装置放置聚胶1 h，配制灌注成层胶。90 V电泳，溴酚蓝倒入分离胶，取出凝胶，放入PVDF膜5～10 s。加进转膜液，冰浴。4℃过夜(杂交液稀释一抗，GAPDH: 1∶1 000)。清洗3次，把膜放入对应的二抗中常温孵育1.5 h，轻轻晃动。加入ECL A和B混合液约1 min，PVDF膜检测采用自动化学发光成像分析。

1.8 qRT-PCR法检测大鼠软骨细胞中TNF-α/NF-κB mRNA的表达量

在大鼠软骨细胞培养液中加入氯仿，摇荡，离心，使溶液呈乳白状，4℃ 1 200 r/min离心，加异丙醇，离心，加75%乙醇离心，干燥，-80℃保存。总RNA提取反转录成cDNA，按照说明书进行实验，内参采用GAPDH，60°C，10 min、95℃、72°C，各 30 s 、95℃，5 min，循环次数以40为准，实验次数至少3次，用相对定量2-ΔΔCT计算TNF-α/NF-κB表达(表1)。

Tab. 1 Primer sequences

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 帕瑞昔布对大鼠软骨细胞增殖的影响

结果表明，MO组和TR组软骨细胞增殖OD值分别为0.36±0.12和0.67±0.34，显著低于SS组OD值1.12±0.45(P<0.05)，但TR组的OD值却显著高于MO组(P<0.05)。

2.2 帕瑞昔布对大鼠软骨组织病变程度的影响

结果表明，SS组大鼠软骨组织表面光滑，MO组大鼠软骨组织体积缩小，表层结构细胞明显减少；TR组大鼠软骨组织结构基本完整(图1)。

Fig. 1 Degree of chondrocyte lesions (Hematoxylin staining× 400)

2.3 帕瑞昔布对大鼠软骨细胞OARSI评分的影响

结果表明，在7 d时，模型制备成功。TR组、MO组大鼠OARSI评分相近，但随着时间的延长，于18 d和30 d时，TR组的OARSI评分显著低于MO组(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of OARSI scores of chondrocytes in three groups of

2.4 帕瑞昔布对大鼠软骨细胞中TNF-α/NF-κB的蛋白的影响

结果表明，MO组和TR组TNF-α和NF-κB的蛋白表达水平均显著高于SS组(P<0.05)，但TR组TNF-α和NF-κB的蛋白表达水平却显著低于MO组(P<0.05，图2，表3)

Fig. 2 The contents of TNF-α / NF-κB protein in rat chondrocytes

Tab. 3 The contents of TNF-α / NF-κB protein in rat n=5)

2.5 帕瑞昔布对大鼠软骨细胞中TNF-α/NF-κB mRNA的表达量的影响

结果表明，MO组和TR组TNF-α和NF-κB mRNA表达水平显著高于SS组(P<0.05)，但TR组TNF-α和NF-κB mRNA表达水平却显著低于MO组(P<0.05，表4)。

Tab. 4 The expression levels of TNF-α / NF-κB mRNA in chondrocytes of three groups of n=5)

3 讨论

骨关节炎是一种比较常见的关节性病变，在年轻时，普通人的骨关节就有可能有炎症，但多数无明显症状。骨关节炎在人的手关节、膝关节、髋关节、脊柱中膝关节最易发生退变，因此膝骨关节炎发病也最广泛[11]。随着病情的发展，逐渐会出现病变关节的夜间休息痛，关节间隙变窄等，最终患者出现肢体障碍、最终影响正常生活[12]。随着社会的不断发展，膝关节炎的发病率也在迅速增加，膝关节炎是一种比较常见的关节性病变，很多人在青年时期就患有该病，但多数无明显症状。一旦发展严重则会严重影响患者的正常生活，因此，找到有效的治疗方案为医学工作者的关注重点[13]。

本研究结果表明，SS组、TR组细胞增殖OD值比MO组高，TR组关节软骨细胞的增殖情况比SS组相比明显减少。随着时间的增加，TR组大鼠骨关节炎情况逐渐好转，而未服用药物的MO组大鼠病情逐渐恶化。这说明帕瑞昔布作用于机体后，消除软骨部位的炎性因子，促进软骨细胞生长。改善软骨病变程度，进而达到治疗的目的。

灰度显示，MO组TNF-α/NF-κB蛋白表达水平显著上升，TR组蛋白表达水平明显比SS组高。MO组信号通路mRNA表达量最高，SS组最低，TR组mRNA表达量明显比SS组高。研究结果显示，帕瑞昔布在骨关节炎大鼠体内发挥效应显著，能够明显降低TNF-α/NF-κB信号通路的表达水平，抑制其凋亡[14]。动物实验研究检测到骨关节炎大鼠存在高浓度的TNF-α mRNA表达，在正常细胞中检测出TNF-α mRNA呈低表达。因此，可以得出TNF-α在软骨退变和骨关节炎症中起重要作用[15]。研究证实，TNF-α是骨关节炎疾病进程中重要的炎症递质，可促进软骨细胞产生过氧化反应[16]。有研究表明，TNF-α/NF-κB信号通路参与机体内多种细胞的增殖、凋亡过程，在健康生物体内TNF-α/NF-κB信号通路呈现低表达，在患病生物体内TNF-α/NF-κB信号通路呈现高表达，表明其高表达能明显促进细胞凋亡、减少细胞寿命，因此，TNF-α/NF-κB信号通路的表达水平对细胞的生长、凋亡具有重要作用[17]。在本实验中发现，帕瑞昔布作用于模型大鼠时，大鼠体内TNF-α/NF-κB的表达水平随之下降。据报道，帕瑞昔布用药时间与TNF-α/NF-κB的表达水平呈负相关关系，即帕瑞昔布用药时间越长，TNF-α/NF-κB的表达水平越低[18]。帕瑞昔布与TNF-α/NF-κB信号通路的关系为骨关节炎的诊断和治疗提供新的研究思路[19-20]。本研究与上述研究结论相近，有关帕瑞昔布能改善骨关节炎疾病的机制可能与帕瑞昔布抑制TNF-α/NF-κB信号通路的表达来达有关。但由于此次本实验仅使用5只大鼠，样本量较少，实验结果可能存在一定误差，因此，本次实验结果仅为初步结果，尚有待增加样本量进行进一步研究。

综上所述：帕瑞昔布可能通过抑制TNF-α/NF-κB信号通路的表达对骨关节炎大鼠起到治疗作用。