即早基因c-fos在THP-1单核巨噬细胞亚型极化中的差异表达*

陈启文， 吴国栋， 颜治云， 张文成， 张 梅

(1. 天津中医药大学研究生院， 天津 301617； 2. 武警后勤学院， 天津 300309； 3. 天津市肝脏胰腺纤维化与分子诊疗实验室， 天津 300162； 4. 武警特色医学中心心内科， 天津 300162)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CHD)作为危害人群健康的重要疾病之一，近年来呈现出发病率和死亡率逐年上升的趋势，并已经成为引起我国国民死亡的主要原因之一[1]。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)作为CHD的核心病理基础之一，很长时间以来一直受到多方学者的关注与研究。现有研究仍无法完全阐明AS的发病机制，主流学说认为，AS病理起源于血管内皮细胞的损伤，继而出现大量脂质聚集并沉积于内皮下，形成血管内脂质斑块，随着病程的进展，脂质斑块进一步增大阻塞血管可诱发组织器官缺血性损伤，最终引起一系列包括心脑血管在内的临床疾病发生[2]。近年来，基于病理学基础的研究发现，巨噬细胞作为机体重要的免疫细胞，在AS的发生中具有关键的作用[3,4]。其兼有对炎性损伤及组织修复的双向调节能力，使得其一定程度上左右着AS的发生和发展。具体而言，经典活化型巨噬细胞(M1型)具有诱导炎性反应发生、引发炎性细胞聚集及促使泡沫细胞形成等作用；而选择性活化型巨噬细胞(M2型)则具有显著的抗炎作用，并可通过胞葬作用清除坏死细胞残体，从而发挥组织修复作用。在AS斑块中，M1型巨噬细胞增多可以显著增加临床中CHD的发病率和死亡率；而斑块内M2型巨噬细胞的增加则可一定程度的稳定和修复斑块，缓解甚至于逆转AS的发生和发展[3,5]。因此，如何有效调节巨噬细胞的亚型分化对于AS的斑块形成具有重要的临床研究价值。

原癌基因c-fos是即早基因(immediate early genes，IEGs)家族中的一员，其与另一IEGs成员c-jun共同组成了AP-1转录因子并参与机体细胞功能的多种信号调节中[6]。不仅如此，尚有研究证实，c-fos还具有独立的非基因组效应功能，能够参与如脂质代谢等相关的细胞功能活动中[7]。有研究发现，在单核细胞向巨噬细胞的分化过程中可通过上调c-fos与c-jun的表达[8]，促进巨噬细胞相关功能基因的转录及翻译，从而调节单核细胞向巨噬细胞的分化过程，表明c-fos在单核细胞向巨噬细胞的分化中具有重要作用，但对其是否参与巨噬细胞的亚型极化作用仍鲜有报道。因此，本实验旨在探讨c-fos作为单核细胞向巨噬细胞分化的重要调节因子，是否在巨噬细胞亚型分化中发挥作用，为研究调节巨噬细胞的亚型分化，靶向干预巨噬细胞对AS斑块的稳定和修复，抑制斑块的破裂等提供新的理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验选用人单核细胞白血病细胞株(THP-1)作为研究对象。细胞购自美国典型培养物保藏中心 (American type culture collection, ATCC)。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；佛波脂(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)购自德国Sigma公司；CD274抗体、CD86抗体、CD163抗体购自万类生物有限公司；GAPDH抗体和c-fos抗体购自武汉Proteintech公司；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 THP-1单核细胞培养

将冻存的THP-1细胞置于40℃恒温水浴锅快速解冻，而后将细胞悬液移置15 ml无菌离心管，并按1∶9比例与RPMI 1640培养基 (含10%胎牛血清，1%青链霉素混合液)混匀，水平离心机离心获得细胞沉淀，以4 ml含血清的培养基重悬后移入培养瓶中，于37℃、5% CO2孵箱内孵育24 h，并定期观察细胞状态及细胞密度，待镜下观察THP-1细胞铺满培养瓶瓶底时进行细胞换液传代、实验铺板及细胞保种等。

1.3 MTT法检测细胞活性

取对数期生长良好的THP-1细胞接种于96孔板，每孔加入含血清的细胞悬液100 μl，细胞数约2×104cells/well，空白孔用无血清培养基填充。将PMA按预设浓度剂量加入各孔，使得终浓度分别为25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml，同时设置零孔，并设3复孔。将细胞置于37℃、5% CO2孵箱内培养6 h，随后往各孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，置于37℃、5% CO2孵箱继续培养4 h后，吸去孔内培养液。向各孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡0.5 min，使结晶物充分溶解。酶标仪OD 560 nm处测量各孔的吸光值。

1.4 实时定量PCR检测基因表达

运用Trizol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计检测260 nm～280 nm处OD值，以确定核酸的纯度及浓度。所提总RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模版扩增c-fos、CD274、CD86、CD163，并以GAPDH作为内参照，采用相对定量法计算获得结果，引物序列见表1所示。相对表达量=2-ΔΔCT，ΔΔCt=(Ct目的基因(待测样品)-Ct内参照(待测样品))-(Ct目的基因(校正样品)-Ct内参照(校正样品))。各引物序列均由上海生工生物技术有限公司合成(表1)。

Tab. 1 Primer sequences formation

1.5 免疫蛋白印迹检测蛋白表达

收集PMA、LPS及IL-4刺激构建的模型细胞，提取各组总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。加入5×SDS上样缓冲液变性蛋白，加样，SDS-PAGE凝胶垂直电泳后，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别以anti-c-fos、anti-CD274、anti-CD86、anti-CD163和anti-GAPDH抗体进行抗原抗体结合，4℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，室温孵育1 h，ECL化学发光显影。凝胶成像系统进行图像采集和分析，GAPDH蛋白条带作为内参照，以目的蛋白条带与GAPDH蛋白条带灰度的百分比值作为目的蛋白表达的相对水平。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 PMA对单核细胞向巨噬细胞分化的影响

相关文献报道，T淋巴细胞激活剂PMA可在体外诱导人单核细胞分化为早期巨噬细胞[8,9]，因此，实验起始，首先探索了PMA诱导单核细胞分化的最佳溶度。采用MTT法检测不同药物浓度变化对单核细胞分化过程中细胞活性的影响。结果显示，25 ng/ml的PMA即可诱导悬浮的THP-1单核细胞分化为贴壁的巨噬细胞(图1)。随着药物浓度增加，药物毒性逐渐增强，当药物浓度超过100 ng/ml时，大量单核细胞死亡并悬浮于培养基中(表2)，更换培养基后，镜下观察可见贴壁的巨噬细胞显著减少，表明PMA药物浓度能够影响实验细胞活性。因此，我们选取25 ng/ml作为PMA的最适诱导浓度。

Fig. 1 The optimal concentration of PMA-induced differentiation of THP-1 monocytes into macrophages. THP-1cells were incubated with different concentrations of PMA (0, 25, 50, 100 200, 400 ng/ml) for 6 h

Tab. 2 Effect of different concentrations of PMA on cell

2.2 PMA诱导 THP-1单核细胞分化过程中c-fos表达变化

为观察c-fos在模型中的变化，检测了PMA诱导THP-1单核细胞分化过程中，c-fos的表达。当PMA刺激在1 h时即可在mRNA水平观察到c-fos的表达上调，并在6 h达到峰值(表3)。而蛋白水平结果较mRNA稍滞后，在3 h时监测到c-fos表达显著上调，并在12 h达到峰值(图2)。该结果提示，c-fos在PMA诱导THP-1单核细胞向巨噬细胞分化的过程中表达上调，其可能在单核细胞向巨噬细胞分化中发挥作用。

Fig. 2 PMA-induced protein expression of c-fos. THP-1 cells were treated with PMA (25 ng/ml) for different time intervals (0, 1, 3, 6, 12, 24 h)

Tab. 3 PMA-induced mRNA and protein expression levels of c-fos at different times n=3)

2.3 LPS诱导巨噬细胞向M1型极化过程中c-fos的表达变化

为了进一步研究c-fos是否参与巨噬细胞极化过程，在PMA诱导THP-1单核细胞向巨噬细胞分化的基础上，探讨c-fos在巨噬细胞亚型分化中的表达变化。参阅相关文献资料，在PMA诱导的基础上，选取了1 μg/ml的LPS作为刺激浓度[10]，诱导THP-1巨噬细胞向M1型巨噬细胞亚型分化，并运用实时定量PCR技术及Western blot技术检测M1型特异性标记物的表达以验证细胞的极化模型。其中，CD86被认为是M1型巨噬细胞的特异性标记物，而CD163及CD274则被认为在M2型巨噬细胞中表达[3]。结果显示，LPS刺激24 h能够显著上调M1型特异性标记物CD86蛋白的表达，并抑制了M2型特异性标记物CD163蛋白表达，而CD274在LPS刺激24 h时表现出蛋白表达的降低(图3A和表4)。该结果表明，LPS能够有效诱导了THP-1巨噬细胞向M1型极化。

Tab. 4 LPS-induced protein expression levels of CD274, CD86 and CD163 in THP-1 cells n=3)

随后，检测了该极化过程中，c-fos的mRNA和蛋白的动态变化。结果显示，LPS刺激在早期即表现出对c-fos的抑制作用，其蛋白和mRNA水平均显著降低，而后随着刺激时间延长，c-fos的mRNA表达水平逐渐恢复(表5)，而LPS对c-fos的蛋白表达抑制时间更长，超过了24 h(图3B)。该结果提示，LPS诱导THP-1巨噬细胞向M1型极化的过程中可抑制c-fos的表达。

Fig. 3 LPS-induced protein expressions of c-fos, CD274, CD86 and CD163. THP-1 cells were treated with PMA (25 ng/ml) for 6 h and stimulated with LPS (1 μg/ml) for 24 h after changed medium

Tab. 5 LPS-induced protein and mRNA expression levels of c-fos in THP-1 cells at different times n=3)

2.4 IL-4诱导巨噬细胞向M2型极化过程中c-fos的表达变化

进一步，为了观察c-fos是否在M2型巨噬细胞的极化过程中发挥作用，我们在PMA刺激构建THP-1巨噬细胞的基础上，运用IL-4(10 ng/ml)[11]诱导THP-1细胞极化为M2型巨噬细胞，并分析了亚型特异性标记物的表达变化。结果显示，IL-4刺激THP-1巨噬细胞24 h后，M2型特异性标记物CD274的蛋白表达升高，CD163同样表现出蛋白水平上调的趋势，而M1型巨噬细胞特异性标记物CD86的蛋白表达降低明显，该结果表明IL-4刺激可诱导THP-1巨噬细胞向M2型极化(图4A，表6)。之后，动态观察c-fos在该过程的表达变化，我们发现，随着IL-4刺激时间延长，c-fos在THP-1巨噬细胞中表现出mRNA和蛋白表达显著上调，并在6h达到峰值(图4B，表7)。该结果提示IL-4在诱导THP-1巨噬细胞向M2型极化的过程中可上调c-fos的mRNA和蛋白表达。

Fig. 4 IL-4-induced protein expressions of c-fos, CD274, CD86 and CD163. THP-1 cells were treated with PMA (25 ng/ml) for 6 h and stimulated with IL-4 (10 ng/ml) for 24 h after changed medium

Tab. 6 IL-4-induced protein expression levels of CD274, CD86 and CD163 in THP-1 cells n=3)

Tab. 7 IL-4-induced protein and mRNA expression levels of c-fos at different times n=3)

3 讨论

巨噬细胞表现出亚型和功能的多样性使得其在AS的病变过程中即充当推动者的作用，又能表现出保护和修复的作用，具有及其复杂的功能调节机制[12]。新进的多项研究聚焦于巨噬细胞的亚型极化及其功能的表达，并取得一定成果。如Ganta等人的研究发现，microRNA-93可通过调控干扰素调节因子-9及其下游通路的表达，促进M2型巨噬细胞极化，从而使缺血肌肉血运重建[13]；Chen HH等人的实验则发现，干扰素调节因子2结合蛋白2(interferon regulatory factor 2-binding protein 2，IRF2BP2)可通过抑制巨噬细胞向M1型极化，减少巨噬细胞引发的炎症反应，并可降低AS的易感性[14]。表明调节亚型极化对于AS及其引起的CHD等相关疾病具有重要的临床价值。

c-fos作为AP-1调节因子重要的组成部分，是细胞功能调节的重要因子之一。其作为即早基因，在受到相关刺激调控后即可快速表达，并通过调节下游相关基因的转录和翻译，调控细胞的生长、发育和分化等功能[7,15,16]。既往研究已经证实，c-fos在机体单核细胞向巨噬细胞的分化的过程中与c-jun共同表达并参与细胞分化调节，但在巨噬细胞亚型分化中是否有作用鲜有报道。因此，本实验旨在观察c-fos在巨噬细胞亚型极化中的表达变化，探究c-fos是否在巨噬细胞亚型极化中也发挥作用。本文结果显示，c-fos在PMA诱导THP-1单核细胞向巨噬细胞分化的过程中表现出显著上调的趋势，说明c-fos在单核细胞向巨噬细胞分化的过程中即以发挥相关的调节作用，这与既往的研究结果相同。随后，本实验参考既往研究的方法，选取LPS(1 μg/ml)及IL-4(10 ng/ml)作为药物刺激，诱导THP-1巨噬细胞向M1型或M2型极化，并观察c-fos在该过程中的表达变化。结果显示，c-fos在LPS诱导巨噬细胞向M1型极化的过程中表达显著降低，其蛋白抑制时长甚至超过了24 h；而在IL-4刺激诱导巨噬细胞向M2型极化的过程中，c-fos表达显著升高。运用实时定量PCR及Western blot技术对细胞亚型标记物进行分析的结果显示，LPS诱导巨噬细胞极化表现出与M1亚型相关的CD86表达上调和M2亚型相关的CD163、CD274表达降低，表明LPS刺激有效诱导了THP-1巨噬细胞向M1亚型极化；反之，IL-4刺激后，细胞则表现CD163、CD274的上调和CD86的降低，表明IL-4刺激诱导了THP-1巨噬细胞向M2亚型极化的过程。综合上述结果，推测c-fos很可能在巨噬细胞的亚型极化中发挥着重要作用，其在M1型极化中表达降低，在M2型极化中的升高可能预示着c-fos具有调节并促进M2型形成，抑制巨噬细胞向M1型极化的作用。

综上所述，本实验结果表明c-fos在巨噬细胞亚型分化中的差异表达，并推测c-fos在不同亚型极化中可能具有相反的作用。这很有可能成为巨噬细胞的亚型及功能调节的一个新作用靶点，值得更进一步的深入研究。由于巨噬细胞亚型功能在AS中表现出的双向调节作用，因此巨噬细胞亚型极化在AS及其相关疾病的临床预防和治疗中具有较好的前景。