高效液相色谱法测定复方夏天无片中原阿片碱和苯甲酰乌头原碱含量

2020-03-15李学英

中国药业 2020年5期

陈芳，李倩，李学英

（山东省德州市中医院脑病科，山东德州 253000）

复方夏天无片是由夏天无、夏天无总碱、制草乌、人工麝香等中药组方，具有祛风逐湿、舒筋活络等功效，可用于风湿瘀血阻滞、经络不通引起的关节肿痛、肢体麻木、屈伸不利、步履艰难，临床常用于治疗风湿性关节炎、坐骨神经痛、脑血栓形成后遗症及小儿麻痹后遗症见上述证候者[1-6]。2015 年版《中国药典（一部）》中复方夏天无片含量测定仅检测原阿片碱的含量[7]，用于表征夏天无和夏天无总碱的量，缺少制草乌中苯甲酰乌头原碱的含量测定，不能较好地控制制剂质量。本研究中建立了检测复方夏天无片中的原阿片碱和苯甲酰乌头原碱含量的高效液相色谱（HPLC）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪，包括Waters 2998 DAD 型检测器（美国沃特世科技公司）；Agilent Zorbax Eclipse SB-C18色谱柱（美国安捷伦科技公司）；XS 204ME 型电子天平（瑞士梅特勒科技公司）；Milli-Q IQ 7000 型超纯水仪（德国默克密理博科技公司）；KQ-300TDE 型超声波清洗机（昆山舒美超声设备公司）。

1.2 试药

复方夏天无片（江西天施康中药股份有限公司，批号分别为190405，180721，181215，规格为每片0.32 g）原阿片碱对照品（批号为110853-201805，含量为99.6%），苯甲酰乌头原碱对照品（批号为111794-201705，含量为99.1%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（美国Fisher 集团）均为色谱纯；乙酸铵、冰乙酸、磷酸（上海化学试剂厂）均为分析纯；超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：0.1%冰乙酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 ～5 min 时94%A，5 ～27 min 时94%A→58%A，27 ～30 min 58%A →94%A，30 ～35 min 94%A）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：264 nm；进样量：25 μL。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

取原阿片碱和苯甲酰乌头原碱标准品各25.0 mg，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加1%盐酸溶液5.0 mL及甲醇溶液12.0 mL，超声溶解，取出，放冷，加70%甲醇至刻度（每1 mL 含原阿片碱和苯甲酰乌头原碱均为0.5 mg），摇匀，即得混合对照品溶液。取复方夏天无片样品10 片，研细，取约1.0 g，精密称定，置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇约40 mL，超声提取（功率为300 W，频率为60 Hz）约25 min；取出，放冷，加70%甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。按处方和工艺制备缺夏天无、夏天无总碱和制草乌的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.2 项下3 种溶液和试剂空白溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录色谱图，见图1。结果表明，在该色谱条件下，供试品溶液色谱中各被测组分峰分离良好，且阴性对照无干扰，方法专属性良好。

线性关系考察：取混合对照品溶液适量，制成质量浓度为0.25，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/mL 的标准溶液，加70 %甲醇至刻度，摇匀，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。以原阿片碱和苯甲酰乌头原碱的质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得原阿片碱和苯甲酰乌头原碱的回归方程分别为Y原=16.109X+8.763（r=0.999 5）和Y苯=212.095X+11.689（r=0.999 6）。结果表明，原阿片碱和苯甲酰乌头原碱质量浓度均在0.25 ～10.0 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取混合对照品溶液（质量浓度为0.5 μg/mL），按拟订色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果原阿片碱和苯甲酰乌头原碱峰面积的RSD分别为2.08%和2.41%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试样品（批号为180721）溶液，室温下放置0，3，6，9，12，24 h，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果原阿片碱和苯甲酰乌头原碱峰面积的RSD分别为2.33%和2.97%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h 内稳定。

重复性试验：取样品（批号为180721）10 片，研细，取约1.0 g，精密称定，置50 mL 容量瓶中，分别精密称取6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果原阿片碱和苯甲酰乌头原碱峰面积的RSD分别为2.63%和3.65% （n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为180721）10 片，研细，取约1.0 g，精密称定，置50 mL 容量瓶中，分别取6份，精密称定，分别加入混合对照品溶液适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取复方夏天无片（批号分别为190405，180721，181215），按2.2 项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定峰面积，并计算样品含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 测定波长选择

取原阿片碱对照品，配制质量浓度为10.0 μg/mL的标准溶液，加70 %甲醇至刻度，摇匀，即得波长测试溶液，依法配制苯甲酰乌头原碱波长测试溶液。开启紫外可见分光光度计，在200 ～400 nm 波段对上述溶液分别进行光谱扫描。结果原阿片碱和苯甲酰乌头原碱分别在236 nm 和290 nm 波长处有最大吸收，为使2 种待测成分有较好的响应，本研究中选择264 nm 作为检测波长。