长链非编码RNA淋巴样增强因子1反义RNA 1调控miR-339-5p对骨肉瘤细胞增殖和凋亡作用的研究

2020-03-15孙杰万里王俊

中华骨与关节外科杂志 2020年12期

孙杰万里王俊

（黄石市第二医院骨科,湖北黄石 435000）

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的骨肿瘤，死亡率高[1]。虽然在过去的几十年里研究人员花费了大量的努力，但是患者的总体存活率仍然不令人满意[2]。因此，了解骨肉瘤的发病机制对改善患者预后有重要意义。新的证据表明，非编码RNAs，如长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）、微小RNA（microRNAs，miRNAs/miR）等，在骨肉瘤的发病机制、诊断和预后调控中发挥重要作用[3]。lncRNAs是一类非蛋白编码转录产物，有多种生理和病理功能。miRNAs 是一类短链非编码RNA，通过诱导mRNA裂解或翻译抑制来调控基因表达，有高度保守性。同时，lncRNAs 通常通过海绵miRNAs 在各种疾病中发挥作用[4]。根据报道，lncRNA淋巴样增强因子1反义RNA 1（lymphoid enhancer-binding factor 1 anti⁃sense RNA 1,LEF1-AS1）在非小细胞肺癌组织中表达上调，并可促进癌细胞在体内和体外的增殖和迁移[5]，LEF1-AS1 在口腔鳞状细胞癌组织和细胞系中高表达，发挥致癌作用[6]。前列腺癌中的LEF1-AS1表达上调，沉默的LEF1-AS1 抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力[7]。miR-339-5p 在骨肉瘤细胞中显著降低，并且其过表达可抑制骨肉瘤增殖，lncRNA核富含丰富的转录本1（nuclear paraspeckle assembly tran⁃script 1,NEAT1）通过抑制miR-339-5p而在骨肉瘤中充当癌基因[8]。然而LEF1-AS1在骨肉瘤中的生物学意义及机制尚不清楚。本研究旨在考察LEF1-AS1和miR-339-5p 在骨肉瘤组织中的表达，探讨LEF1-AS1 和miR-339-5p 在骨肉瘤U2OS 细胞增殖与凋亡中的生物学功能，以及LEF1-AS1 的分子调控机制，这可能有助于骨肉瘤的早期诊断和靶向治疗。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人骨肉瘤细胞U2OS 购自中国科学院上海细胞生物学研究所，DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）相关试剂盒购自日本TaKa⁃Ra公司，细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8,CCK-8）购自日本Dojindo 公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国Molecular Probes 公司，兔抗P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAP⁃DH）、羊抗兔IgG抗体购自英国Abcam公司。

1.2 临床组织标本

纳入研究的35 例骨肉瘤组织和瘤旁组织（距骨肉瘤部位至少3 cm 处）均来源于本院。骨肉瘤患者术前均未接受放、化疗。患者手术切除后立即将组织保存于液氮中。所有实验和方案获得患者的知情同意，并经医院伦理委员会批准。组织标本采用Trizol试剂进行总RNA的提取，之后用于qRT-PCR检测。

1.3 细胞培养与转染

细胞U2OS在37℃、5%CO2的培养箱中培养，所用培养基为DMEM 培养基，其中包含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。miR-339-5p 模拟物、miR-339-5p 模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-339-5p 抑制剂（anti-miR-339-5p）、抑制剂阴性对照（anti-miRNC）、LEF1-AS1过表达质粒（pcDNA3.1-LEF1-AS1）、过表达质粒（pcDNA3.1）、LEF1-AS1 小干扰RNA（si-LEF1-AS1）、小干扰RNA 阴性对照（si-NC）由上海Genepharma 公司合成。将细胞U2OS 接种到6 孔板中，并在融合70%时使用Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。转染48 h后，收获细胞用于随后的分析。

1.4 qRT-PCR检测LEF1-AS1、miR-339-5p表达

以Trizol 试剂为基础的RNA 提取方案用于从组织或细胞中提取总RNA。按照制造商的说明，通过Prime Script 逆转录试剂盒合成cDNA。使用qRTPCR 试剂盒进行qRT-PCR 反应，2−ΔΔCt法用于量化LEF1-AS1、miR-339-5p表达，LEF1-AS1表达归一化为GAPDH，miR-339-5p 表达归一化为U6。引物序列：LEF1-AS1 5，-AAGGACGAGAGAAAAGCAC-3，（F）和5，-CACACAAAGGGGAAGACC-3，（R），GAP⁃DH 5，-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3，（F）和5，-GGTTGAGCACAGGGTACTTT-3，（R），miR-339-5p 5，-ACACTCCAGCTGCGGTCCCTGTCCTCCAGGAG-3，（F）和5，-TGGTGTCGTGGAGTCG-3，（R），U6 5，-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3，（F）和5，-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3，（R）。

1.5 生物信息学预测和双荧光素酶报告实验

使用starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）工具通过生物信息学分析预测LEF1-AS1和miR-339-5p的假定结合位点。利用pGL3 载体构建靶向LEF1-AS1的野生型（WT）或突变型（MUT）荧光素酶报告基因。对于萤光素酶报告基因测定，使用Lipofectamine 2000转染试剂，在U2OS 细胞中共转染WT-LEF1-AS1 或MUT-LEF1-AS1 和miR-339-5p 模拟物或miR-NC。转染48 h 后，使用荧光素酶报告试剂盒分析各组荧光素酶活性。

1.6 CCK-8检测细胞增殖

根据制造商的方案，使用CCK-8 试剂盒测定细胞增殖。将转染后的细胞U2OS（2×104个/孔）接种到96孔板中，在48 h时加入10µl CCK-8。在37℃下孵育4 h 后，使用Bio-Rad 3550 微孔板读数器计算出450 nm 处的吸光度（OD）值。细胞存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.7 克隆形成实验检测细胞克隆能力

将转染后的U2OS 细胞接种到6 孔板（500 个细胞/孔），并在37℃、含5%CO2的潮湿环境中培养。每2 d 更换一次培养基。2 周后，出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养，将U2OS细胞用PBS洗涤2次，在甲醇中固定40 min，在室温下用1%结晶紫染料染色5 min，并用水漂洗2次，统计细胞克隆形成数。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡

根据制造商的规程，用Annexin-V-FITC 对细胞进行染色。将3×105个U2OS细胞在6孔板中培养，收获并用PBS洗涤。然后，将其重悬于100 μl Annexin-V结合缓冲液中，在室温下与5 μl Annexin-V-FITC孵育15 min，并用碘化丙锭复染（终浓度1 μg/ml）。黑暗中于室温下孵育15 min后，通过流式细胞仪进行分析。

1.9 免疫印迹实验检测P21和Caspase-3蛋白表达

通过RIPA 裂解缓冲液从转染后的U2OS 细胞中提取总蛋白。通过SDS-PAGE 分离等量的蛋白质（20 μg），并转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜在37℃用5%脱脂奶封闭2 h 后，与P21、Caspase-3、GAPDH 一抗（1∶1000稀释）于4℃孵育过夜，之后与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 二抗（1∶5000 稀释）在37℃放置2 h。使用ECL检测试剂使条带可视化。通过使用Image J 软件将P21 和Caspase-3 蛋白条带的灰度与GAPDH的灰度进行比较，来确定相对表达。

1.10 统计学方法

采用SPSS 22.0 进行统计分析。计量资料以均值±标准差表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LEF1-AS1、miR-339-5p 在人骨肉瘤组织和瘤旁组织中的表达

qRT-PCR 检测结果显示，35 例骨肉瘤组织中的LEF1-AS1 表达量高于瘤旁组织，而miR-339-5p 表达量低于瘤旁组织（P＜0.001，表1）。

2.2 抑制LEF1-AS1对细胞U2OS增殖、凋亡的影响

在细胞U2OS 中转染si-LEF1-AS1 发现LEF1-AS1 表达量明显低于转染si-NC 细胞（P＜0.001，表2），表明成功建立抑制LEF1-AS1的细胞。对细胞增殖的检测结果显示，与si-NC组比较，抑制LEF1-AS1显著减少细胞U2OS 的存活率和克隆形成数（P＜0.001，表2，图1C）。流式细胞术检测结果显示，抑制LEF1-AS1 的细胞U2OS 凋亡率明显高于si-NC 组（P＜0.001，表2，图1A）。免疫印迹实验检测结果发现，与si-NC组比较，抑制LEF1-AS1显著提高P21和Caspase-3蛋白水平（P＜0.001，表2，图1B）。

2.3 LEF1-AS1靶向、调控miR-339-5p

starBase 网站预测显示，LEF1-AS1 与miR-339-5p 有靶向结合位点（图2）。双荧光素酶报告实验表明，与miR-NC 组比较，miR-339-5p 明显降低WTLEF1-AS1 的荧光素酶活性（P＜0.001），但不影响MUT-LEF1-AS1 的荧光素酶活性（表3）。qRT-PCR检测数据发现，转染pcDNA3.1-LEF1-AS1 比转染pcDNA3.1 明显减少miR-339-5p 表达量，转染si-LEF1-AS1 较转染si-NC 显著增加miR-339-5p 表达量（P＜0.05，表4）。

2.4 抑制miR-339-5p 能减弱抑制LEF1-AS1 对细胞U2OS增殖、凋亡的作用

与si-LEF1-AS1和anti-miR-NC共转染比较，si-LEF1-AS1和anti-miR-339-5p共转染明显减少细胞U2OS 中miR-339-5p 表达量、P21、Caspase-3 蛋白表达量、细胞凋亡率，显著增加U2OS 细胞存活率和克隆形成数（P＜0.05，表5，图3）。

2.5 过表达miR-339-5p 能增强抑制LEF1-AS1 对细胞U2OS增殖、凋亡的作用

与si-LEF1-AS1 和miR-NC 共转染比较，si-LEF1-AS1和miR-339-5p共转染明显增加miR-339-5p 表达量、P21、Caspase-3 蛋白表达量和凋亡率，显著减少细胞U2OS 存活率和克隆形成数（P＜0.001，表6，图4）。

表1 LEF1-AS1、miR-339-5p在人骨肉瘤组织和瘤旁组织中的表达（）

表2 抑制LEF1-AS1对细胞U2OS增殖、凋亡的影响（，n=9）

图1 抑制LEF1-AS1对U2OS凋亡集落形成P21、Caspase-3的影响

图2 LEF1-AS1靶向miR-339-5p

表3 双荧光素酶报告实验（，n=9）

表4 LEF1-AS1调控miR-339-5p的表达（，n=9）

注：与pcDNA3.1组比较，△P＜0.05；与si-NC组比较，▲P＜0.05

3 讨论

lncRNAs 是一组不编码蛋白质的功能RNA。尽管缺乏蛋白编码能力，但lncRNAs几乎在关键生物学和病理过程的各个方面都发挥了作用[9]。最近的研究证实，lncRNAs在骨肉瘤中的表达失调与疾病的进展、转移和预后有关[10]，可以作为肿瘤抑制基因和致癌基因发挥作用，如lncRNA 重编程调节器（regulator of reprogramming,ROR）[11]、生长停滞特异性转录因子5（growth arrest specific 5，GAS5）[12]、FOXD2-AS1（fork⁃head box D2 adjacent opposite strand RNA1）[13]。已有证据表明，LEF1-AS1的异常表达在肿瘤发生中起重要作用。例如，与匹配的正常组织相比，食管鳞状细胞癌组织中的LEF1-AS1 明显上调，LEF1-AS1 水平升高预示着食管鳞状细胞癌患者的预后不良[14]。LEF1-AS1在肺癌中被上调，其过表达导致细胞增殖和侵袭的增强[15]。胶质母细胞瘤LEF1-AS1表达明显上调，敲除LEF1-AS1可显著抑制胶质母细胞瘤细胞的恶性生物学行为，包括增殖和侵袭，并促进细胞凋亡[16]。这些结果显示，LEF1-AS1 可能是肿瘤发生发展过程中的致癌因子。本研究qRT-PCR 检测发现，与瘤旁组织比较，骨肉瘤组织中的LEF1-AS1表达量明显升高。功能实验结果表明，抑制LEF1-AS1明显降低骨肉瘤细胞U2OS的存活率和克隆形成数，并显著提高凋亡率、P21 和Caspase-3 蛋白水平。说明与前述研究[14-16]一致，LEF1-AS1 同样在骨肉瘤中扮演着癌基因的角色，下调其表达有抑制骨肉瘤细胞增殖，以及促进细胞凋亡的作用，LEF1-AS1 可能是骨肉瘤的关键靶标。

图3 抑制miR-339-5p能逆转干扰LEF1-AS1对细胞U2OS凋亡集落形成及P21、Caspase-3的影响

表5 抑制miR-339-5p能逆转干扰LEF1-AS1对细胞U2OS增殖、凋亡的作用（，n=9）

表6 过表达miR-339-5p能增强抑制LEF1-AS1对细胞U2OS增殖、凋亡的作用（，n=9）

图4 过表达miR-339-5p能增强抑制LEF1-AS1对细胞U2OS凋亡集落形成及P21、Caspase-3的影响

lncRNAs 可以作为骨肉瘤的必要的生物标志物和治疗靶点，发挥竞争性内源性RNAs（competing en⁃dogenous RNAs,ceRNAs）的功能，使miRNAs 能够抑制mRNA 的表达[17]，如MAFG 反义RNA1（MAF BZIP Transcription Factor G antisense RNA 1,MAFG-AS1）对miR-339-5p 的靶向调控[18]。miRNAs 的失调在各种癌症中普遍存在，包括骨肉瘤[19]。miR-339-5p 已被证实在各种癌症中起着抑癌作用。根据报道，肺腺癌[20]、卵巢癌[21]、胰腺癌[22]中的miR-339-5p 表达水平降低，上调miR-339-5p可抑制肺腺癌[20]、卵巢癌[21]细胞的侵袭和迁移，miR-339-5p 低表达是胰腺癌[22]细胞侵袭和迁移能力增强的主要因素。本研究骨肉瘤组织中miR-339-5p表达显著下调，与Zhang等[8]的报道相同，miR-339-5p 可能抑制骨肉瘤进展。生物信息学预测显示，LEF1-AS1 可能靶向miR-339-5p，随后的双荧光素酶报告实验证实了这一观点。另外还发现，干扰LEF1-AS1 对细胞U2OS 增殖的抑制作用，和其对细胞凋亡的促进作用，可被抑制miR-339-5p 表达所减弱，或被过表达miR-339-5p 所增强，说明miR-339-5p是LEF1-AS1的功能性靶基因，LEF1-AS1 影响骨肉瘤细胞增殖和凋亡的功能是通过靶向调控miR-339-5p的表达而实现的。

综上所述，lncRNA LEF1-AS1 在骨肉瘤组织中表达上调，抑制其表达可有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，以及促进骨肉瘤细胞凋亡，作用机制与靶向调控miR-339-5p 的表达有关，为骨肉瘤提供了潜在的生物标志物。