洋槐蜜和椴树蜜结晶前后的主要物质组成和热力学性质变化研究

郭娜娜, 米鑫, 罗其花, 赵亚周

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所, 北京 100093; 2.河北省食品检验研究院, 石家庄 050091; 3.北京市密云区园林绿化局, 北京 101500)

蜂蜜是由蜜蜂从蜜源植物的花朵上采集花蜜或蜜露后，将其贮存于蜂巢内的巢脾中，经充分酿制而成[1]。成熟蜂蜜是一种具有浓郁花香味的天然甜物质，自古至今，因其具有较高的营养价值而被广泛食用[2]。常温下，蜂蜜为半透明的粘稠状液体，低温久存后，会出现部分结晶或全部结晶[3]。蜂蜜的结晶可能与其蜜源种类[4]、物质组成[5]或热力学特征[6]等密切相关。生产或评价不同结晶状态的蜂蜜，不仅能够为消费者提供特色鲜明的产品，而且有助于改进生产工艺，为生产者创造更大的利润。结晶蜂蜜和非结晶蜂蜜的化学组分较为相似，差别多集中在某些成分的物理状态或含量的改变[6]，而蜂蜜的真实性评价对消费者的知情权和企业的信誉度非常重要。从立法角度出发，众多关于蜂蜜的质量标签已经建立，根据质量标签要求，需规定每种产品的特殊状态及重要物理特征[7-8]。从经济学的角度出发，生产消费者接受度高的蜂蜜，如结晶蜂蜜或固体蜂蜜等，可进一步提高产品的附加值。因此，如何科学阐明结晶蜂蜜的具体特征是一个技术问题，其基本要点为：利用某种技术手段准确评价结晶状态的蜂蜜，并保证其质量稳定。

目前，评价结晶状态蜂蜜质量常用的方法主要有3种。第1种是检测某些特殊化学物质的含量，其前提是假设这些物质在某种蜂蜜中的含量比较固定。理论上讲，针对多种目标物质的多因素分析方法可以将差异样品从特定样品组中分离出来[6,9]。然而，蜂蜜样品因采集方式、储存条件及加工技术等差异会导致这些目标物质的含量发生变化，进而造成检测结果异常[10-12]。并且，这种方法需要运用化学计量法、主成分分析、线性判别分析或人工神经网络分析等评价各组数据间的相似或差异程度，存在分析过程繁琐、数据量大等缺陷。第2种方法是在特定状态蜂蜜中寻找一种特殊标记，可以是某种化学成分(如复合物、分子、核酸等)或形态成分(如植物细胞)以证明蜂蜜来源的真实性[13-14]。第3种方法是基于蜂蜜的整体信息，主要运用物理分析技术检测某种来源蜂蜜整体的物理化学特性，而非仅仅检测一种物理化学指标，比如pH、电导率、水分含量、灰分等[15-17]。差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)可以分析蜂蜜整体的热动力学特性，分析过程中，其热力学和动力学参数(如比热容、反应热、转变热、相图、反应速率、结晶速率、高聚物结晶度、样品纯度等)会随着加热温度或时间的变化而发生改变[18-19]。

目前，针对蜂蜜结晶的研究主要集中在如何生产结晶态蜂蜜及优化其品质。比如，自然结晶的蜂蜜分为液相和晶相。液相蜜含水量高于19%，晶相蜜含水量低于12%，使得液相蜜中容易繁殖酵母从而导致蜂蜜发酵和变质[20]。利用人工干预的方法使蜂蜜完全结晶，可以使蜂蜜中的水分均匀分布，有利于运输和贮存，并保持蜂蜜成分稳定和天然香味[21]。再者，蜂蜜的成分主要包括单糖、水分、酶类和维生素。单糖占大部分，其中葡萄糖占26%～43%，果糖占32%～46%，蜂蜜中的葡萄糖含量是引起蜂蜜结晶的主要因素。蜂蜜结晶是葡萄糖围绕结晶核形成颗粒，并在颗粒周围包上一层果糖、蔗糖或糊精的膜，逐渐聚结扩展，而使整个容器中的蜂蜜部分或全部形成松散的固态状，即蜂蜜结晶[22]。因此，蜂蜜结晶是一种正常现象，对其组成成分和应用价值没有影响。区别于以往研究，本研究重点研究了蜂蜜结晶前后的物理化学特性及DSC技术在蜂蜜检测方面的优势，通过对不同蜜源、不同结晶状态蜂蜜的物质组成进行分析，再利用DSC技术研究其热力学特征，以期实现对不同蜜源或不同结晶状态蜂蜜特征和质量的科学评价。

1 材料与方法

1.1 蜂蜜样品及蜜源信息

蜂蜜样品采自我国相应蜜源主产区的意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)蜂场，包括2种蜜源、2种状态的蜂蜜样品(表1)。其中，样品编号根据蜂蜜的蜜源植物简写，具体为结晶椴树蜂蜜(DG)、非结晶椴树蜂蜜(DY)、结晶洋槐蜂蜜(YG)、非结晶洋槐蜂蜜(YY)。所有样品均为蜜源植物开花流蜜季节中期采集的封盖蜜，采样时间为2017年5—7月。每个采样地点一般聚集有10个以上的养蜂户，且各自之间的距离超过5 km，养殖规模一般为100群左右。每种蜂蜜样品从3个蜂场平行采集3次，共计12个样品，各样品采样量为50 g。非结晶态蜂蜜4 ℃下密封保存，结晶态蜂蜜的处理方式为14 ℃储存6个月以上，取完全结晶蜂蜜作为样品。蜂蜜样品蜜源信息的确认，主要依靠采访养蜂户、调查采样点蜜源植物种类及专业人员的感官鉴别等。

表1 蜂蜜样品信息

1.2 水分含量测定

利用阿贝折射仪(AR12, Germany Schmidt+Haemsch股份有限公司)测定样品的含水量。首先于20 ℃条件下测定样品的折光率[23]，再利用Wedmore[24]提出的换算表格进行含水量换算。每个样品重复测定3次。

1.3 水分活度测定

利用水分活度仪(LabMaster-aw, Swiss Novasina股份有限公司)测定样品的水分活度(water activity, Aw)。首先在温度18～25 ℃、湿度50%～80%的条件下，利用饱和NaCl溶液对水分活度仪进行校正。然后，称取5 g(精确至0.01 g)样品放入样品皿，进行水分活度测定。每隔5 min记录一次水分活度仪的响应值，当相邻两次响应值之差小于0.005时，即为测定值。每进行一次测定后，需进行重新校对，同一样品重复测定3次。

1.4 葡萄糖和果糖含量测定[25]

1.4.1标准溶液配制 标准贮备溶液：分别称取葡萄糖、果糖标准品1、4、5 g(精确到0.000 1 g)，放入100 mL容量瓶中，加入60 mL水溶解，乙腈(色谱纯)定容，摇匀。

标准工作溶液：吸取不同体积的葡萄糖、果糖标准贮备溶液到100 mL容量瓶中，用乙腈和水混合液(体积比40：60)稀释，配成不同浓度的葡萄糖、果糖标准工作溶液，用于绘制标准工作曲线。

1.4.2试样制备 对于非结晶样品，用干净玻璃棒搅拌均匀。对于结晶样品，在密闭情况下，置于不超过60 ℃的水浴中温浴、震荡，当样品全部融化后搅匀，冷却至室温。

1.4.3称量提取 称取试样5 g(精确至0.000 1 g)，置于100 mL烧杯中，加入30 mL水，用玻璃棒搅拌至试样完全溶解。转移至100 mL容量瓶中，乙腈定容，摇匀(同时制作2个平行样及试剂空白样)。静置片刻后，用孔径0.45 μm滤膜过滤，向液相色谱(配有示差折光检测器)进样。

1.4.4液相色谱测定 利用流动相(乙腈∶水=70∶30，使用前用孔径0.45 μm滤膜过滤，超声脱气)稳定2 h后，调节仪器平衡，基线及示差检测器显示数字波动较小时，即可上样测定。

色谱柱：Kromsil氨基柱，4.6 μm×250 mm；流速1 mL·min-1；示差折光检测器温度30 ℃；进样量10 μL。

1.5 DSC测定

采用功能补偿型DSC(Perkin-Elmer股份有限公司)进行样品分析。试验前需利用铟和锌溶液标准品进行DSC温度和功率的校准，采用空坩埚进行基线扫描，仪器的加热或降温程序在持续的氮气气氛中进行。样品量为5～10 mg，密封在铝制坩埚(容积为100 μL)中，加热速率为5 ℃·min-1，样品的升温范围为-80～150 ℃，温度变化幅度为±1 ℃。

1.6 数据分析

利用SPSS 18.0进行数据统计分析。对不同样品的水分含量、水分活度、葡萄糖和果糖含量及热力学指标等数据进行单因素方差分析，采用独立样本t检验对不同样品的相应数据进行差异性比较，利用Bivaruate correlation方法进行相关性分析。采用Origin 8.5绘制数据图。

2 结果与分析

2.1 蜂蜜样品中水分和糖分的组成

蜂蜜样品中果糖含量、葡萄糖含量、水分含量和水分活度分析结果见图1。在果糖和葡萄糖含量方面，蜜源的影响比结晶状态更加显著。同一蜜源的果糖和葡萄糖含量没有显著差异；但是，无论是结晶态还是非结晶态，洋槐蜂蜜和椴树蜂蜜之间均存在显著差异(P<0.05)。洋槐蜂蜜的果糖含量明显高于椴树蜂蜜(P<0.05)，而洋槐蜂蜜的葡萄糖含量则明显低于椴树蜂蜜(P<0.05)。然而，不同蜜源或不同结晶状态的蜂蜜样品，在水分含量和水分活度2个指标上均没有显著差异。由于蜂蜜在水分活度低于0.6的情况下，不利于酵母菌的生长[23]，因此相比椴树蜜，洋槐蜜的水分活度可能更不利于酵母菌滋生。

注：不同小写字母表示差异在P<0.05水平具有统计学意义。

2.2 蜂蜜样品DSC曲线分析

由图2可以看出，在-80～150 ℃的变化范围内，同种结晶状态蜂蜜(不同蜜源)的DSC曲线较为相似，主要差别为玻璃转化温度(glass transition temperature, Tg)、放热峰峰温(endothermic peak temperature, Tpk)和放热峰大小等，但是差别较小。无论是非结晶态，还是非结晶态，洋槐蜜的Tg均低于椴树蜜，而洋槐蜜的Tpk均高于椴树蜜。同种蜜源蜂蜜(不同结晶状态)的DSC曲线则差异显著，如Tg、Tpk、放热峰大小和形状均表现出了明显差别。

注：Tg为玻璃转化温度，Tpk为放热峰峰温。

2.3 蜂蜜样品DSC参数分析

DSC试验中主要选取了差别较为明显的参数进行分析，包括Tg、Tpk和放热峰焓变(endothermic peak enthalpy change,ΔH)。由图3可以看出，同种结晶状态蜂蜜的ΔH没有差别，而不同结晶状态蜂蜜的ΔH差异显著(P<0.05)。同种结晶态蜂蜜YG和DG的Tg差异显著(P<0.05)，而YY和DY的Tg没有差别，不同结晶态蜂蜜Tg之间的差异显著(P<0.05)；同种结晶态蜂蜜YY和DY的Tpk差异显著(P<0.05)，而YG和DG的Tpk没有差别，不同结晶态蜂蜜的Tpk差异显著(P<0.05)。结果说明，Tg、Tpk和ΔH对于区分不同蜂蜜样品较为灵敏。以Tg、Tpk和放热焓变ΔH作为坐标轴绘制三维坐标图(图4)，可以看出，同种结晶状态蜂蜜样品的热力学性质较为相似，与蜂蜜的蜜源关系不大。

注：不同小写字母表示差异在P<0.05水平具有统计学意义。

图4 基于DSC参数的不同蜂蜜样品的相似性分析

2.4 蜂蜜样品物质组成和热力学参数的相关性分析

表2可以看出，ΔH与Tpk(r=-0.983,P<0.05)、Tg与Tpk(r=-0.986,P<0.05)呈显著负相关；ΔH与Tg(r=0.966,P<0.05)呈显著正相关；其余各热力学参数之间或热力学与物质之间没有表现出明显的相关性。结果表明，蜂蜜的物质组成与其热力学参数没有明显的相关性，即蜂蜜的蜜源特征可能对其热力学性质影响不大。

表2 蜂蜜样品物质组成和热力学参数的相关性分析

3 讨论

本研究以不同蜜源和不同结晶状态蜂蜜作为试验材料，探讨了其物质组成和热力学特征及其之间的相互关系。有研究认为，蜂蜜的水分活度会随着结晶程度的加深而增高[16,26-27]。比如，Gleiter等[16]研究认为，结晶蜂蜜的水分活度普遍高于液体蜂蜜。本研究也出现相似趋势，但是变化不明显，分析原因，可能是本研究中所选取蜂蜜样品的水分含量本身较低及蜂蜜结晶程度不足所致。随着蜂蜜结晶程度加深，其水分活度随之增高，很容易超过酵母菌生长的阈值(水分活度约为0.6)，形成利于酵母菌滋生的环境[26]。这种现象也在其他食品研究中得到了证实，比如奶酪、牛奶等均会由于过高的水分活度导致酵母菌发酵变质[28]。所以，结晶或半结晶状态的蜂蜜更加适宜酵母菌的生长而产生发酵现象[29]。随着食品检测技术的进步，蜂蜜的水分活度测定变得更加便捷和快速，所以，若将其作为蜂蜜微生物的评价标准，替代原有的微生物培养检测法，将大大提高检测的时效性。并且，通过控制蜂蜜(包括液态蜂蜜和固态结晶蜂蜜)的水分活度，可以更有效地延长商品的货架期。

高分子理论认为，高分子的结构和性能方面存在着一定的联系，非晶态的高聚物从玻璃态到橡胶态存在着玻璃化转变，这时高聚物的性质会发生急剧变化[30]。蜂蜜主要为葡萄糖和果糖形成的复杂体系，且葡萄糖易形成水合葡萄糖，具有玻璃态向橡胶态转变的趋势，因此存在着玻璃转化现象[17,31]。本研究也发现，无论是非结晶态还结晶态蜂蜜，均存在明显的玻璃转化温度，而且蜜源或结晶状态的变化均会引起玻璃转化温度的改变。与玻璃转化温度相似，放热峰焓变和放热峰峰温也在不同蜜源或结晶态的蜂蜜样品间，存在明显差异。相似性分析和相关性分析结果均表明，蜂蜜的热力学参数与其结晶状态相关，而与物质组成(蜜源)关系不大。不同结晶状态的蜂蜜之间存在明显的热力学参数的差异。Venir等[31]研究认为，不同意大利Tarassaco蜂蜜样品的热力学参数因结晶状态的不同而差异明显。故通过检测蜂蜜样品的热力学参数，可以有效评价蜂蜜的结晶程度，这种方法可能在蜂蜜的加工储藏过程中起到重要作用。

综上所述，本研究认为蜂蜜的水分活度与结晶程度和水分含量有关，通过监测蜂蜜的水分活度有助于控制微生物(尤其是酵母菌)的滋生。蜂蜜热力学参数与其结晶状态有关，可通过测定蜂蜜的玻璃转化温度、放热峰峰温和放热峰焓变等指标，预测蜂蜜的结晶程度。总之，热力学参数结合水分活度等指标，可以判断、预测蜂蜜的货架期和贮藏期，帮助择定有效的蜂蜜加工与贮藏条件等。