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产气荚膜梭菌生长所需最低水分活度研究*

2022-04-20任文鑫杨晓莉毋堃杰李宏铎

中国药业 2022年7期
关键词:活度梭菌产气

夏 天 ,崔 迎 ,任文鑫 ,杨晓莉 ,毋堃杰 ,李宏铎 △

(1. 陕西省西安市食品药品检验所·国家药品监督管理局重点实验室,陕西 西安 710054; 2. 陕西省食品药品监督检验研究院,陕西 西安 710065)

水分活度由澳大利亚科学家Scott 于1953 年提出,是指产品水蒸气压与同温度下纯水蒸气压的比值[1-2]。其在本质上可理解为结合水含量越高,水分活度越低[2],可用于微生物生长繁殖的水越少[3-4]。作为微生物可利用水量度的重要参数,水分活度也是影响微生物生长的关键因素[5],在食品和化妆品的微生物控制方面已有应用[6-7]。2006 年,《美国药典》1112 章节中已发布水分活度测定在非无菌制剂中的应用指导原则[8]。本研究中参考该指导原则中产气荚膜梭菌生长所需的最低水分活度(0.95)及文献[9 - 12],分别以氯化钠、葡萄糖和甘油作为水分活度调节剂,调节培养基的水分活度值在 0.90~0.99 范围内[2,13],测定产气荚膜梭菌生长所需的最低水分活度,以为《中国药典》相关内容的增订提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与菌种

仪器:Aqualab 4TE 型水分活度仪(美国Meter Group Inc.);THERMO1378 型生物安全柜(赛默飞世尔科技有限公司);LRH-250 型生化培养箱(上海一恒科技有限公司);SX - 500 型高压蒸汽灭菌器(日本Tomy公司);SQP 型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司,精度为10 mg)。

试剂:硫乙醇酸盐流体培养基(FTM,北京三药科技开发公司,批号为170808);胰胨- 亚硫酸盐- 环丝氨酸琼脂培养基(TSC,北京路桥技术有限责任公司,批号为171108;氯化钠(批号为20180509),丙三醇(批号为20180223),均购自国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号为20180110)。

菌种:产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,广东环凯生物科技有限公司,编号为ATCC 13124,工作用菌株为第3代)。

1.2 方法

不同水分活度培养基的配制:分别以氯化钠、葡萄糖及甘油作为水分活度调节剂,并测定其灭菌后的水分活度值,制备不同水分活度的FTM。以3 种水分活度调节剂的质量对培养基水分活度值绘制标准曲线。

产气荚膜梭菌菌液的制备:将产气荚膜梭菌转接至FTM中,(36±1)℃厌氧培养24 h,用无菌生理盐水稀释,制备成不同浓度的菌悬液。

定性试验:按标准曲线,配制水分活度在0.90~0.99 范围内梯度为0.01 的系列FTM;同时配制不调节水分活度的FTM,作为对照组(T0)。取产气荚膜梭菌菌悬液,分别加入上述FTM 中,每管装量20 mL,使菌液浓度达到102cfu/mL。各组培养物置(36±1)℃温度条件下厌氧培养30 d,逐日观察生长情况,目测判断,浑浊表明有生长,澄清表明未生长。

定量试验:通过定性试验,初步获得产气荚膜梭菌在不同介质的FTM 中生长所需最低水分活度,选择最低水分活度附近3 个水平,即低于水分活度限值0.01(T1)、水分活度限值(T2)和高于水分活度限值0.01(T3),同时配制不调节水分活度的FTM,装量均为100 mL,接种产气荚膜梭菌菌悬液,使菌液浓度达到102cfu/mL。于(36 ± 1)℃温度条件下培养,分别于0,2,16,18,20,24,42,48,72,90,120,144 h时以TSC 培养计数。以测得平均菌落数的对数值(logcfu)对时间(t,h)作图,绘制生长曲线,重复3次。

2 结果

2.1 不同介质调节FTM 水分活度的标准曲线绘制

由图1 可知,随着氯化钠、葡萄糖和甘油质量的增加,水分活度呈下降趋势。相同水分活度时,3 种水分活度调节剂质量差异较大。当水分活度为0.98时,每100 mL FTM 中分别需要添加氯化钠3.51 g、葡萄糖13.80 g、甘油9.08 g。

图1 FTM中3种水分活度调节剂质量-水分活度标准曲线A.NaCl B.Glucose C.GlycerolFig.1 Standard curves of quality - water activity of three water activity regulators in FTM

2.2 定性试验结果

以氯化钠、葡萄糖和甘油为水分活度调节剂的FTM 中,产气荚膜梭菌的最低生长水分活度分别为0.98,0.98,0.95。这与《美国药典》中产气荚膜梭菌生长所需最低水分活度(0.95)[8]一致。

2.3 定量试验结果

产气荚膜梭菌在3 种不同水分活度调节剂中的生长曲线见图2。从生长曲线来看,以氯化钠和葡萄糖调节FTM 水分活度时,产气荚膜梭菌生长所需最低水分活度均为0.98;以甘油作调节剂时为0.95,与定性试验结果一致。根据定性试验结果,以氯化钠和葡萄糖调节水分活度时,T1,T2,T3应分别为0.97,0.98,0.99,但T3与对照组水分活度相同。为保证试验完整性,并探讨产气荚膜梭菌在水分活度限值以下的生长情况,本研究中将氯化钠和葡萄糖介质中T1,T2,T3调整为0.96,0.97,0.98。

图2 不同介质FTM中产气荚膜梭菌的生长曲线A.NaCl B.Glucose C.GlycerolFig.2 Growth curves of Clostridium perfringens in FTM with different media

由图2 可知,水分活度会影响产气荚膜梭菌的生长。产气荚膜梭菌在水分活度较高时生长较旺盛,在水分活度较低时生长缓慢,低于一定值时则停止生长甚至死亡。由图2 A和图2 B可知,产气荚膜梭菌在水分活度大于0.98时生长较快,低于0.98时不生长,且3次试验结果一致,重复性良好,表明以氯化钠和葡萄糖调节水分活度,产气荚膜梭菌最低生长水分活度为0.98。由图2 C可知,当水分活度为0.96时,生长较快,生长趋势与对照组相似;当水分活度为0.95 时,虽有生长现象,但其生长趋势明显弱于0.96,表明以甘油调节水分活度,产气荚膜梭菌最低生长水分活度为0.95。

由图2可知,水分活度与产气荚膜梭菌的菌液浓度呈正相关,产气荚膜梭菌的菌落数随水分活度的降低而减少。同时,水分活度为0.98 时,氯化钠的菌液浓度对数值略低于对照组,葡萄糖的低于氯化钠;甘油在水分活度为0.95 时的菌液浓度对数值显著低于对照组,第2次试验中表现尤为明显。不同介质调节水分活度会影响产气荚膜梭菌生长迟缓期的长短。由图2 A 可知,水分活度为0.98时,产气荚膜梭菌的迟缓期为0~20 h。由图2 B 可知,水分活度为0.98 时,产气荚膜梭菌的迟缓期为0~40 h,且其生长先短暂停滞,随着时间的延长生长繁殖逐渐恢复。由图2 C 可知,当水分活度高于0.95 时,产气荚膜梭菌生长较快,16 h 即开始对数生长期;当水分活度为0.95时,产气荚膜梭菌44 h后开始进入对数期,迟缓期时间相对较长。表明产气荚膜梭菌出现临界生长状态,与产气荚膜梭菌生长所需最低水分活度(0.95)的结果一致。

3 讨论

在厌氧培养条件下,以氯化钠和葡萄糖为水分活度调节剂,当水分活度低于0.98时,产气荚膜梭菌停止生长;以甘油为水分活度调节剂,当水分活度低于0.95时,产气荚膜梭菌停止生长。其中,产气荚膜梭菌对甘油最耐受。相同菌液接种量下,甘油的0 h 菌落数对数值高于葡萄糖,氯化钠最低。这可能是因为产气荚膜梭菌是一种革兰阳性厌氧菌[14],甘油可作为厌氧菌的一种保存助剂[15],可在一定程度上促进其生长。

大多数微生物的代谢活动需要水分子参与,水分活度降低会导致微生物的代谢活性降低[16]。本研究结果表明,随着水分活度的降低,产气荚膜梭菌的生长活性逐渐受到抑制。由生长曲线可知,产气荚膜梭菌菌液浓度的降低,停滞时间的延长,都与水分活度降低呈正相关。水分活度与微生物的生长密切相关,是判断微生物风险与控制产品质量稳定性的重要指标,但目前微生物污染控制方面的应用和研究仍属罕见[17-18]。故有必要深入研究水分活度在非无菌药品微生物检验中的应用,以缩短药品放行周期,降低库存成本和检测成本。

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