实时荧光RT-PCR检测塞内卡病毒

熊 杰，张昕彤，胡生富，陈富忠，魏春梅

（1.攀枝花市动物疫病预防控制中心，四川攀枝花617000；2.武陟县农业农村局）

塞内卡病毒（Senecavirus,SVA），曾被称为塞内卡谷病毒（Seneca valley virus,SVV），为无囊膜的单股正链RNA病毒，是小RNA病毒科塞内卡病毒属唯一成员[1]，基因组全长约7.2kb[2]，是美国基因治疗公司在2002年利用人胚胎视网膜细胞培养腺病毒时偶然发现的污染物[3]。SVA主要导致发病猪蹄部和口鼻出现水疱、溃烂、跛行；新生仔猪出现腹泻、神经症状并引起急性死亡，死亡率在15%～30%[4]。2007年从加拿大运往美国明尼苏达州的病猪中检测出了SVA[5]，2014年巴西等国家大规模暴发疫情，2015年3月广东省出现国内第1例SVA引发的猪水疱病疫情，2016年，国内研究人员首次成功分离到了SVA中国毒株并完成全基因组系列的测定[6]。目前该病在我国个别地区零星散发，有流行扩大的趋势，对我国生猪产业造成潜在威胁，为了解该病是否在攀枝花地区流行，对全市各县（区）送检样品进行实时荧光RT-PCR检测。

1 材料与方法

1.1 材料

材料来源于攀枝花市东区、西区、钒钛高新区、仁和区、米易县和盐边县规模场、屠宰场和散养户的猪血清，共计100份，见表1。检测试剂为北京世纪元亨塞内卡病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，批号SV20190513P。

表1 样品来源及数量

1.2 检测方法

采用吸附柱法提取RNA后，参照北京世纪元亨塞内卡病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.1 设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为N,则反应体系配制如下：无菌无核酸酶水：7.0×（N+1)μL;RT-PCR反应液：12.5×（N+1)μL；酶混合液：1.0×（N+1)μL；荧光探针：2.5×（N+1)μL。

1.2.2 将以上配制的反应体系充分混合后，分装每个反应管中各23μL。

1.2.3 分别取2μL模板RNA，加入相应反应管中，混匀并做好标记，其中SVA荧光报告基团为FAM，猝灭基团为None.在荧光PCR仪上进行以下反应：42℃5min,95℃10s;95℃5S,60℃35s,在每个循环第二步（60℃35s）收集荧光信号，共40个循环。

2 结果判定

2.1 结果有效性

阳性对照Ct值≤30并出现特异性扩增曲线，阴性对照无CT值并且无特异性扩增曲线，实验结果成立。见图1和表2，阳性对照Ct值26.46，出现特异性扩增曲线，阴性对照无CT值并且无特异性扩增曲线，所以本实验结果有效。

图1 实时荧光定量RT-PCR扩增曲线

2.2 结果

实验中所有样品均为塞内卡病毒抗原阴性。

3 讨论

SVA导致猪出现的临床症状与与口蹄疫病毒（Foot and mouth diseasevirus,FMDV）、猪传染性水疱病病毒（Swine Vesicular Disease Virus,SVDV）、水疱性口炎病毒（vesicularstomatitis virus,VSV)和猪水疱性皮疹（Vesicular Exanthemaof Swine Virus,VESV）所致临床症状相似[1]，很难区别，要通过实验室检测进行鉴别诊断。目前的实验室诊断主要包括病毒分离鉴定、分子杂交、RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR和ELISA等方法，由于实时荧光定量RT-PCR方法用时短、特异性强、灵敏度高，是目前普遍采用的快速诊断方法。虽然攀枝花市未发生SVA疫情，但对该病要高度重视，做好流行病学调查与监测预警工作，本实验对攀枝花各县（区）进行全覆盖抽样监测，未发现SVA核酸阳性样品，表明该市未发现SVA感染情况。