感染旋毛虫小鼠免疫能力的性别差异研究

王 敏, 罗晓磊, 沈 磊, 宁 晓, 肖朝江, 姜 北

旋毛形线虫简称旋毛虫，是一种寄生线虫，可以感染人类及其他哺乳动物而引起旋毛虫病[1]。旋毛虫病是一种严重的食源性人兽共患寄生虫病[2]，主要因食用感染旋毛虫的生肉或未煮熟的肉而引起，在全球范围内仍然是一种严重的传染病[3]，而且严重影响猪肉生产和食品安全[4]。云南大理白族人民有生食猪肉的传统习俗，因此感染旋毛虫病的风险更大，是当地的主要危害性寄生虫病之一。

旋毛虫病的临床表现不明确，临床诊断比较困难[5]。目前，肌肉活检和血清学检查常被用于诊断人类旋毛虫病[6]。旋毛虫不同于其他蠕虫，因为它的生命周期是在单一宿主体内完成的，包括2个不同的寄生部位，肠上皮细胞和骨骼肌细胞[7]。感染性幼虫侵入小肠上皮细胞，经历4次蜕皮大约在31 h发育成熟至成虫阶段，雌、雄成虫交配，产生新生幼虫，随血液及淋巴液循环移行至全身各器官，并侵入骨骼肌内发育，幼虫周围形成囊包后完成生命周期[8]。许多生物体的雄性和雌性通常容易感染同一种寄生虫，但感染后在免疫反应的强度或类型上会表现出明显的差异[9]。可能是由于性激素对免疫系统的影响，从而导致寄生虫和寄主性别之间在感染的发生率及对寄生虫的耐受力上存在差异[10-11]。对大鼠和小鼠的研究证实，雄性的体液免疫和细胞免疫通常低于雌性[12]。曾有文献报道旋毛虫感染哺乳动物及人类存在雌雄差异，但将小鼠的性腺切除后这种差异就有所减小[13]。因为雄性物种分泌的睾酮可以抑制机体的免疫功能，而雌性物种分泌的雌二醇会增强免疫功能。对田鼠进行雌雄性别感染差异的实验中就证实雄性田鼠比雌性更易感染旋毛虫[14-15]。另有研究证明雌二醇、黄体酮、睾酮在旋毛虫的体外实验中也存在明显差异，雌二醇及黄体酮抑制旋毛虫蜕皮，而睾酮却没有影响[16]。新生小鼠接触双酚A至性成熟后感染旋毛虫，由于性激素的影响导致雌性小鼠小肠成虫数明显低于雄性小鼠[17]。为进一步明确性别与旋毛虫感染之间的关系，本文就雌雄昆明小鼠感染旋毛虫早期在免疫能力上是否存在差异进行了研究。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级昆明种小鼠80只，5周龄左右，体质量18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。实验动物生产许可证号SCXK(湘)2016-0002。动物实验完全依照大理大学医学伦理委员会及大理大学药学与化学学院实验动物管理委员会的相关规定进行。

1.2虫种来源 本实验所用旋毛形线虫(Trichinellaspiralis)由大理大学基础医学院寄生虫学教研室惠赠。

1.3主要试剂与仪器 流式细胞仪FACS Calibur(BD公司)；酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)；CO2孵育箱(日本三洋电气公司)；M700E倒置显微镜(日本尼康公司)；XFA6130型全自动动物血液细胞分析仪(南京普朗生物医学有限公司)；FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse CD25，均购自BD公司(货号：557307，553075；批号：8127689，8066576)；IL-2、IL-4、IL-10 Elisa试剂盒购自南京建成生物工程研究所(货号：20190508；批号：20191107)。

1.4实验分组与旋毛虫感染 昆明种小鼠80只，雌雄各半，随机分为8组，每组10只。4组为雌性小鼠，另4组为雄性小鼠，分别感染0、200、400、800条旋毛虫。

1.5指标测定 各组小鼠于感染后第7 d尾静脉取血20 μL，加入至1.6 mL血细胞稀释液中，混匀后于全自动动物血液细胞分析仪测定白细胞组成比例；眼眶后静脉丛采血，室温静置30 min后3 500 r/min离心10 min，收集血清用Elisa试剂盒测定血清中IL-2、IL-4、IL-10的浓度。处死小鼠后，称体质量，脾脏和胸腺组织质量，计算脏器指数=脏器质量(g)/体质量(g)×100%；部分组织于10%中性甲醛中固定24 h后，石蜡包埋，切片，HE染色观察组织变化；部分脾脏组织用PBS制成细胞悬液，加入红细胞裂解液裂解后，离心重悬，调整淋巴细胞浓度为1.0×106/mL，再加入FITC标记的抗小鼠CD4抗体3 μL和 PE 标记的抗小鼠CD25抗体4 μL 4℃避光孵育30 min，于流式细胞仪测定CD4+CD25+T 细胞(即免疫调节性T细胞)的百分比。

2 结 果

2.1脏器指数 雌雄小鼠感染不同剂量旋毛虫后的脏器指数如表1所示，正常雌雄性小鼠的脾脏指数无明显差异，但正常及感染200条雌性小鼠的胸腺指数高于雄性小鼠(t0=3.248,P<0.05;t200=4.595,P<0.01)。小鼠感染不同剂量旋毛虫后，雌性小鼠脾脏和胸腺指数均未见显著变化，其比较无统计学意义(F=0.809,P>0.05；F=1.157,P>0.05)；雄性小鼠脾脏指数变化也不明显，然而其胸腺指数较正常组有显著的升高，各组间比较差异有统计学意义(F=3.782,P<0.05)。表明感染旋毛虫后，雄性小鼠的胸腺明显肿大，而雌性小鼠未发现此现象。

2.2白细胞组成比例 各组小鼠白细胞组成比例测定结果见表2，与正常组相比，感染旋毛虫后雌雄小鼠的淋巴细胞百分比有不同程度的下降，单核细胞和粒细胞百分比有不同程度的上升(F=3.875，P<0.01；F=2.460，P<0.05)。比较感染旋毛虫后，雌雄小鼠的差异发现：雄性小鼠的白细胞组成比例变化更为显著，表现为淋巴细胞百分比下降更明显，而单核细胞和粒细胞百分比上升更多，其中，800条旋毛虫感染小鼠后，与雌性小鼠相比，雄性小鼠的淋巴细胞和单核细胞百分比差异具有统计学意义(tLY=2.604，P<0.05;tMO=-2.448，P<0.05)。

表1 感染不同剂量旋毛虫小鼠脏器指数(n=10)
Tab.1 Organ index of mice infected with different doses ofTrichinellaspiralis(n=10)

Infection Dose(TS/mouse)Organ index (%,female / male)SpleenThymus00.26±0.05 / 0.23±0.070.44±0.12 / 0.20±0.06①2000.25±0.03 / 0.23±0.040.43±0.02 / 0.31±0.06②4000.28±0.04 / 0.27±0.070.40±0.11 / 0.35±0.068000.29±0.04 / 0.24±0.070.41±0.05 / 0.34±0.07

Compared to female mice infected withT.spiralisat the same dose, ①P<0.01, ②P<0.05

表2 感染不同剂量旋毛虫小鼠白细胞组成比例(n=10)
Tab.2 Composition of white blood cells in mice infected with different doses ofTrichinellaspiralis(n=10)

Infection Dose(TS/mouse)WBC (%,female / male)LYMOGR080.30±3.57 / 78.53±3.615.37±1.34 / 5.12±2.1514.37±2.38 / 16.34±2.7420073.30±8.53② / 74.02±7.227.12±1.95 / 6.63±2.7219.58±7.67② / 19.34±4.8540074.28±4.95 / 69.70±7.39③7.39±1.67② / 8.43±1.60③18.31±3.45 / 21.84±5.89④80079.99±6.85 / 66.50±3.25④⑥5.44±3.01 / 11.00±1.27③⑥14.61±4.60 / 22.55±4.45④

WBC: White Blood Cell; LY: Lymphocyte; MO: Monocyte; GR:Granulocyte；TS:Trichinellaspiralis

Compared to the normal female group, ①P<0.01, ②P<0.05; compared to the normal male group, ③P<0.01, ④P<0.05; compared to female mice infected with T. spiralis at the same dose,⑤P<0.01, ⑥P<0.05.

2.3胸腺组织病理变化 结果见图1，正常组中，雌雄小鼠胸腺组织的皮质和髓质的界限较为清楚，雌性小鼠的皮质明显多于髓质，而雄性小鼠的皮质与髓质的比例相当。感染200、400条旋毛虫后，雌雄小鼠的皮质与髓质分界仍清楚，皮质区可见排列整齐、密集的淋巴细胞，小叶间隔清晰可见，雌雄之间并不存在明显差异。但感染800条旋毛虫后，雌性小鼠的髓质比例有所减小，皮质淋巴细胞排列不整齐，而雄性小鼠的髓质中可见有小血管分布，皮质变化不明显。

2.4脾脏组织病理变化 结果见图2，正常组中，雌雄小鼠脾脏结构完整，白髓和红髓分界以及脾小梁雌性较雄性更为清晰。感染200、400、800条旋毛虫后，雄性小鼠白髓和红髓的分界较雌性更为清晰。雄性小鼠的脾小梁较为密集，而雌性小鼠的脾小梁则较为稀疏。雌雄之间在结构上确实存在差异，但在感染的剂量上并未呈现出明显差异。

2.5血清IL-2、IL-4、IL-10含量测定 结果见表3，与正常组相比，感染旋毛虫后雌性小鼠的IL-2上升，雄性小鼠下降；IL-4含量雌雄小鼠均上升(F=5.664,P<0.05，P<0.01)；除感染400条旋毛虫组外，IL-10含量均有不同程度的上升。比较旋毛虫感染后的雌雄小鼠差异发现：IL-2的含量雌性上升，雄性下降，且感染800条旋毛虫组雄性显著低于雌性(t=3.615,P<0.05)。IL-4含量雄性上升趋势高于雌性，IL-10含量变化趋势雄性高于雌性，但各组之间差异并不具有统计学意义(F=1.170,P>0.05)。

表3 感染不同剂量旋毛虫小鼠白细胞介素含量(n=10)
Tab.3 Interleukin levels in mice infected with different doses ofTrichinellaspiralis(n=10)

Infection Dose(TS/mouse)Interleukin levels (ng/L,female / male)IL-2IL-4IL-100400.84±29.56 / 379.53±23.3259.25±7.92 / 42.90±13.67192.94±4.76 / 202.73±27.30200414.73±100.86 / 361.04±55.8370.69±22.60 / 89.57±17.03③205.86±27.73 / 227.01±21.85400464.08±98.41 / 350.95±42.9169.89±16.65 / 94.95±31.34③191.83±37.66 / 192.88±41.36800478.16±49.67 / 346.80±38.66⑥91.69±15.20② / 102.81±18.13③238.01±7.44 / 231.71±47.00

TS:Trichinellaspiralis

Compared to the normal female group, ①P<0.01, ②P<0.05; compared to the normal male group, ③P<0.01, ④P<0.05; compared to female mice infected with Trichinella spiralis at the same dose, ⑤P<0.01, ⑥P<0.05.

2.6脾脏免疫调节性T细胞 流式细胞术检测CD4+CD25+(即免疫调节性T细胞)比例，结果表明，与正常组相比，感染旋毛虫后，雌性小鼠的免疫调节性T细胞均上升，但各组之间比较差异无统计学意义(F=1.037,P>0.05)。感染400条旋毛虫后，与雄性正常小鼠比较，其免疫调节性T细胞明显上升，两组之间比较差异有统计学意义(F=5.088,P<0.01)，但同一感染量雌雄之间进行独立样本t检验后差异无统计学意义(t0=-0.485,P>0.05;t200=0.813,P>0.05;t400=-1.715,P>0.05;t800=0.526,P>0.05)，结果见图3。

3 讨 论

旋毛虫寄生在寄主体内，在不严重损害寄主的情况下逃避寄主的免疫，从而平衡与寄主免疫系统的关系。旋毛虫侵袭小肠时会引起肠道细胞的高收缩，导致嗜酸性粒细胞增多，从而刺激炎症的产生，进而诱发Th1和Th2免疫反应。Th1细胞分泌IL-2及IFN-γ，介导细胞毒及局部炎症反应，清除细胞中的病毒、细菌及寄生虫。Th2细胞分泌IL-4、IL-10刺激B细胞增殖及产生抗体，清除游离的微生物。然而，过于强烈的免疫反应不仅会杀死外来物质，还会影响寄主自身。因此，当存在过强的免疫反应时，免疫调节性T细胞(Treg细胞)被激活，与Th1、Th2共同发挥免疫调节作用[18-20]。

脏器指数结果显示雌雄小鼠感染不同数量旋毛虫后，仅对雄性小鼠胸腺指数有一定影响。胸腺和脾脏的组织学检查结果显示胸腺的结构雌雄之间并不存在明显差异，但脾脏组织学检查结果却显示感染旋毛虫后对雌性小鼠脾脏的影响较为显著。白细胞组成比例结果显示雌雄小鼠感染不同数量旋毛虫后其淋巴细胞百分比降低，单核细胞、粒细胞百分比较正常组升高。此结果与文献[21]报道一致，血液或组织中嗜酸性粒细胞水平的增加历来被认为是哺乳动物寄生虫感染的一个显著特征，且嗜酸性粒细胞的应答并不呈现出感染剂量依赖性。IL-2含量测定结果显示感染旋毛虫的雌性高于雄性。IL-4、IL-10含量雄性均高于雌性。Treg中 CD4+CD25+的比例显示与正常对照组相比其比例均上升，感染200、800条旋毛虫的雄性小鼠低于雌性，其余各组 CD4+CD25+的比例雄性高于雌性。根据以上结果提示感染旋毛虫后雄性小鼠的免疫能力强于雌性小鼠。

有文献报道[14-15]旋毛虫感染哺乳动物及人类存在雌雄差异，因为雄性物种分泌的睾酮可以抑制机体的免疫功能，而雌性物种分泌雌二醇会增强免疫功能。因而推测可能是由于性激素的分泌，从而导致雌性的Th1免疫反应强于雄性，刺激IL-2的分泌使其含量高于雄性，IL-2含量的升高促进寄主的细胞免疫。雄性的Th1免疫较弱可能转而增强Th2免疫，进而导致体液免疫增强即刺激Th2型细胞因子IL-4、IL-10的分泌，故IL-4、IL-10的含量雄性小鼠高于雌性小鼠[22]。IL-10含量的升高会增强Treg的免疫反应，从而导致 CD4+CD25+的比例与正常对照组相比雌雄均升高且雄性高于雌性。在旋毛虫感染中，嗜酸性粒细胞具有免疫调节作用，可以刺激树突状细胞和CD4+细胞进而刺激IL-10的产生。在感染旋毛虫后的最初几个小时内，嗜碱性细胞和肥大细胞是Th2细胞因子的重要供体。且结果显示感染旋毛虫后粒细胞比例雄性高于雌性，因此导致雄性小鼠的Th2免疫反应强于雌性[23-25]。有研究报道旋毛虫在感染后10-28 h侵入小肠粘膜层，停留2-3周。感染后1、2周小肠的Treg细胞数量增加，实验结果也显示Treg(CD4+CD25+)比例在感染旋毛虫后升高，与文献报道的结果一致[26]。但是各项指标测定结果并未呈现出显著的感染剂量依赖性，可能是由于寄主感染较多数量旋毛虫后，在空间(即在肠道上皮细胞)和营养物质产生激烈竞争，以及寄主对旋毛虫的排出作用，导致高剂量感染后可能对寄主免疫产生抑制作用[27]。对于寄主在旋毛虫感染后引起的反应存在很大变异，这是由遗传决定的。可能与主要组织相容性复合体(MHC)有关，也可能与非MHC相关基因有关[28]。结合以上脏器指数、白细胞组成比例、胸腺和脾脏组织学检查、IL-2、IL-4、IL-10含量以及Treg(CD4+CD25+)的比例可以看出，感染旋毛虫后雄性小鼠的免疫反应强于雌性小鼠，但造成这种现象的主要原因还有待进一步研究。

利益冲突：无

引用本文格式：王敏，罗晓磊，沈磊, 等. 感染旋毛虫小鼠免疫能力的性别差异研究[J].中国人兽共患病学报，2020，36(1):01-06. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.189