COI基因DNA条形码技术在福建省蜱类鉴定中的应用

周淑姮，肖方震，刘维俊，刘 菁，韩腾伟，邓艳琴，2

蜱是一类重要的医学和兽医学昆虫，可传播多种自然疫源性疾病，包括斑点热、莱姆病、人粒细胞无形体病、人埃立克体病、森林脑炎、克里米亚-刚果出血热、发热伴血小板减小综合征、Q热等，给人类健康及畜牧业带来很大危害,因此研究蜱类具有重要的医学和经济学意义。蜱的种类繁多，全球已知18属896种[1]，我国报道有2科10属119种[2],同一种蜱可传播多种不同疾病，确定蜱的种类是防制蜱和蜱传疾病的首要任务[3]。

近年DNA条形码鉴定技术由于不受物种发育阶段及个体形态特征的影响，同时能发现形态学鉴定无法辨认的隐存种，已作为一种新型手段在物种鉴定、生物多样性研究等领域扮演着重要角色并被广泛应用[4]。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因在保证有足够变异的同时又能被通用引物扩增，且拥有线粒体基因组很少存在插入和缺失的特点，片段长度也很适合解析亲缘关系相近的分类类群[5]，因此，常被选作DNA条形码鉴定系统的目标基因，目前已被广泛地应用于昆虫的种类鉴定以及发现隐存种。

目前，国内外应用COI基因鉴定蜱类的研究不多[6-13]，本研究对福建省常见的12种蜱进行DNA条形码鉴定，并结合传统形态学鉴定进行分析，验证COI基因作为DNA条形码在蜱类鉴定中的有效性。

1 材料与方法

1.1标本来源 蜱标本来源于2012年以来福建省鼠传及蜱传疾病(鼠疫、钩端螺旋体病、流行性出血热、发热伴血小板减少综合征等)疫源地调查及监测工作。采集的标本于95%酒精-80 ℃中保存备用。

1.2蜱形态学鉴定 在体视显微镜(Olympus SZX9)下观察蜱标本，参照蜱分类检索表及相关文献[14-16]进行形态学分类鉴定。

1.3基因组DNA提取 取单只蜱标本，用ddH2O清洗3次后,无需研磨，直接使用Qiagen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit，参照试剂盒说明书提取蜱的总DNA，置于-20 ℃保存备用。提取DNA后的蜱标本用ddH2O清洗后于75%酒精中保存，用于形态鉴定的复核。

1.4PCR扩增 扩增COI基因所采用引物为动物DNA条形码通用引物[11]，即LCO1490(5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′)和HCO2198：(5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′), 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μL PCR扩增反应体系中，含有Premix Taq酶12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、蜱DNA模板3 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min后以98 ℃变性10 s、47 ℃退火30 s，68 ℃延伸1min、循环35次，68 ℃总延伸7 min。每次反应均设阴性对照与空白对照。

1.5序列测序 取3 μL扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果，目标条带纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6序列处理与分析 用BioEdit软件进行多重序列比对，并进行适当的人工调整；再运用MEGA6.0软件分析各基因序列的碱基组成，基于Kimura-2-parameter 模型计算遗传距离。选取每种蜱种内遗传距离最小的2个样本中的1个样本，登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库，将其序列经BLAST同源性比对，根据序列相似度选择参考株。依据Hebert[5,17]的研究结果(除肠腔动物外，98%物种的种内遗传距离差异为0～2%)，判断形态学与COI基因DNA条形码鉴定结果的一致性。运用MEGA6.0软件，采用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis，BP) 重复检测1 000 次。

2 结 果

2.1形态学鉴定结果 经形态学鉴定，用于基因组DNA提取的97只蜱标本隶属于5属12种，其基本信息见表1。

2.2蜱类COI基因片段序列分析 研究所用引物位于COI基因5′端，成功扩增出蜱类12种97条COI序列，长度约为650 bp，经BioEdit软件比对后保留了626个位点。采用MEGA6.0软件进行序列组成分析，结果显示COI基因序列中保守位点有351个，变异位点有275个，简约信息位点有263个，自裔位点有12个。同时A、T、C和G的平均含量分别为29.5%，37.9%，17.5%和15.1%，其中A+T含量(67.4%)远高于G+C含量(32.6%)，表现明显的A+T碱基偏嗜，符合节肢动物线粒体基因碱基组成的基本特征[18]。

表1 本研究蜱标本的基本信息
Tab.1 Basic information of ticks in this study

属种采集地点宿主数量(性别/发育期)样品编号花蜱属Amblyomma龟形花蜱A.testudinarium浦城家猪7(♀3♂4)PC-ATE01～PC-ATE07革蜱属Dermacentor台湾革蜱D.taiwanensis大田青毛鼠2(N1L1)DT-DTA01,DT-DTA02浦城野猪1(♂1)PC-DTA03邵武青毛鼠2(N2)SW-DTA04,SW-DTA05周宁野猪2(♀2)ZN-DTA06,ZN-DTA07血蜱属Haemaphysalis褐黄血蜱H.flava柘荣麂2(♀1♂1)ZR-HFL01,ZR-HFL02周宁麂7(♀2♂5)ZN-HFL03～ZN-HFL09台岛血蜱H.formosensis柘荣麂5(♀2♂3)ZR-HF001～ZR-HF005浦城野猪2(♀1N1)PC-HF006,PC-HF007浦城麂1(N1)PC-HF008周宁麂1(♀1)ZN-HF009周宁野猪4(♀1♂3)ZN-HF010～ZN-HF0013豪猪血蜱H.hystricis柘荣野猪3(♀1♂2)ZR-HHY01～ZR-HHY03柘荣麂1(♂1)ZR-HHY04大田青毛鼠2(N2)DT-HHY05,DT-HHY06周宁野猪3(♀2♂1)ZN-HHY07～ZN-HHY09越原血蜱H.Yeni周宁野猪1(♀1)ZN-HYE01周宁野兔1(♂1)ZN-HYE02周宁麂5(♀2N3)ZN-HYE03～ZN-HYE07硬蜱属Ixodes粒形硬蜱I.granulatus宁德褐家鼠3(♀1♂1N1)LD-IGR01～LD-IGR03浦城黄毛鼠2(♀2)PC-IGR04,PC-IGR05霞浦针毛鼠1(♂1)XP-IGR06尤溪黄毛鼠2(L2)YX-IGR07,YX-IGR08卵形硬蜱I.ovatus浦城麂2(♀2)PC-IOV01,PC-IOV02周宁麂6(♀6)ZN-IOV03～ZN-IOV08宁化野猪2(♀2)NH-IOV09～NH-IOV10中华硬蜱I.sinensis宁化野兔3(♀3)NH-ISI01～NH-ISI03周宁麂5(♀5)ZN-ISI04～ZN-ISI08基刺硬蜱I.spinicoxalis浦城麂2(♀2)PC-ISP01,PC-ISP02扇头蜱属Rhipicephalus微小扇头蜱R.microplus永春牛11(♀9N1L1)YC-RMI01～YC-RMI11永春犬1(♀1)YC-RMI12浦城牛2(♀1♂1)PC-RMI13,PC-RMI14血红扇头蜱R.sanguineus福州犬3(♀3)FZ-RSA01～FZ-RSA03

注：♀为雌性，♂为雄性，N为若虫，L为幼虫。

2.3遗传距离差异分析 在 MEGA6.0中，用Kimura-2-Parameter 模型分别计算12种蜱97条COI基因序列的种内与种间遗传距离(表2)。种内遗传距离变动范围为0～7.14%，平均为1.65%，其中卵形硬蜱与微小扇头蜱的种内遗传距离与其余的10种蜱虫种内遗传距离存在较大差异，分别为5.46%与7.14%；种间遗传距离变动范围为14.65%～26.79%，平均为18.58%，种间遗传距离显著大于种内遗传距离。

表2 12种蜱虫COI基因序列的种内与种间的遗传距离(%)
Tab.2 Intra- and inter- specific genetic distances of 12 species of ticks based on the sequence of mitochondrial COI genes(%)

种类数量种内遗传距离(最大值)种间遗传距离 龟形花蜱台湾革蜱褐黄血蜱台岛血蜱豪猪血蜱越原血蜱粒形硬蜱卵形硬蜱中华硬蜱基刺硬蜱微小扇头蜱血红扇头蜱龟形花蜱70.31台湾革蜱71.5616.02褐黄血蜱90.3118.0718.07台岛血蜱131.1417.2317.6814.65豪猪血蜱90.4617.7119.5114.9316.81越原血蜱71.4818.6319.7617.0818.1614.80粒形硬蜱50.4619.0619.2321.2717.4821.9619.49卵形硬蜱107.1423.3123.4823.8023.9922.6724.7017.92中华硬蜱80.6721.9622.2823.0320.1020.3421.8116.7718.11基刺硬蜱20.7823.1523.9624.9824.1322.1623.7319.9219.5616.93微小扇头蜱145.4615.4216.7415.4314.8815.1417.3020.1023.8022.5322.63血红扇头蜱3017.8218.7818.1217.2118.8217.6120.7823.8325.5126.7915.86

2.4BLAST同源性比对分析 12种蜱的COI基因片段序列分别通过BLAST同源性比对(表3)，结果显示，形态学鉴定为越原血蜱及基刺硬蜱的标本，未发现与之相匹配的高相似度的参考株，相似度最高者H.concinna与I.ricinus,遗传距离均>10%，说明越原血蜱与基刺硬蜱的COI基因序列尚未上传至GenBank数据库，通过比对，仅能鉴定至属名；褐黄血蜱、台岛血蜱、豪猪血蜱、粒形硬蜱、微小扇头蜱与血红扇头蜱等6种蜱与参考株的名称一致，且遗传距离均小于2%，表明形态学鉴定与DNA条形码鉴定结果一致；卵形硬蜱同I.ovatuscomplex sp. Group 3遗传距离为4.47%，考虑为不同隐存复合群；与形态鉴定为龟形花蜱的样本具有高相似度的参考株除了龟形花蜱外还有A.pattoni，而形态鉴定为台湾革蜱、中华硬蜱的样本，其DNA条形码鉴定结果则完全不一致，与台湾革蜱高相似度的参考株有D.reticulatus、D.auratus、D.steini，与中华硬蜱高相似度的参考株有I.nipponensis与I.asanumai。

2.5系统发育分析 基于Kimura-2-parameter 模型，利用MEGA6.0软件邻接法构建蜱类COI基因序列的系统发育树(图1)，从种的水平上看，微小扇头蜱与卵形硬蜱的所有个体分别聚为一支，但均存在2个(或3个)高度分化的支系, 并且具有很高的置信度(>99%), 表明微小扇头蜱与卵形硬蜱可能至少包含2个(或3个)隐存的复合群，其余10种蜱的所有不同个体连同高相似度的参考株均分别聚集成簇，形成各自的单独一支，节点置信度均为100%。参考株A.pattoni同龟形花蜱聚在同一支，D.reticulatus、D.auratus、D.steini同台湾革蜱聚在同一支，I.nipponensis与I.asanumai同中华硬蜱聚在同一支，此结果与上述同源性比对分折结果一致，说明实验标本同对应的参考株为同一物种的可能性大。从属的水平上看，花蜱属与革蜱属因种类单一，不能分析其属内亲缘关系；扇头蜱属3个种类汇成一个单系；但血蜱属与硬蜱属不能形成相互独立的单系，属间存在着同源交叉。从置信度数值上看，每分支(同种)节点置信度均高达99%以上，而种间节点置信度则普遍较低。此研究结果表明，对于蜱分子系统亲缘关系的研究，COI基因适合在较低阶元(种)间进行，但是对于较高级阶元(如属)尚不适用，这与高博等[21]、吴荣泉等[22]的研究结果相符。

3 讨 论

本研究采用的蜱样本除了成虫外尚有若虫和幼虫，不同发育期的同种虫体其遗传距离均在种内变动范围内，在系统发育树上均能聚集在同一支，证实了DNA条形码技术鉴定不受虫体发育阶段的影响。本研究在提取基因组DNA后，虫体仍能保持其形态完整性，这对实验后的形态复核以及稀有种的保存起着重要作用，同时也证实了DNA条形码鉴定技术只需微小的量即能完成，可用于形态无法辨别的残缺标本。

表3 12种蜱虫COI基因片段序列的BLAST同源性比对
Tab.3 BLAST homology comparison of 12 species of ticks

样品编号 形态学鉴定参考株 GenBank 登录号序列相似度(%)遗传距离PC-ATE03龟形花蜱A.testudinariumA.testudinariumHM193893.199.41 0.59 A.pattoniHM193876.199.70 0.30 A.pattoniHM193875.199.05 0.95 ZN-DTA07台湾革蜱D.taiwanensisD.reticulatusHM193884.198.73 1.27 D.reticulatusHM193886.198.56 1.44 D.auratusMG721047.198.60 1.40 D.steiniHM193861.198.26 1.74 ZN-HFL06褐黄血蜱H.flavaH.flavaJQ737097.199.11 0.89 H.flavaKY021819.198.82 1.18 ZR-HF002台岛血蜱H.formosensisH.formosensisJX573135.198.68 1.32 DT-HHY06豪猪血蜱H.hystricisH.hystricisNC_039765.199.25 0.75 H.hystricisJX573137.199.10 0.90 ZN-HYE05越原血蜱H.YeniH.concinnaKY364906.187.70 12.30 PC-IGR04粒形硬蜱I.granulatusI.granulatusMG721046.199.25 0.75 I.granulatusKM497429.199.38 0.62 PC-IOV01卵形硬蜱I.ovatusI.ovatus complex sp. Group 3MH208687.196.10 3.90I.ovatus complex sp. Group 3MH208690.295.53 4.47NH-ISI02中华硬蜱I.sinensisI.nipponensisKY606284.199.51 0.49 I.nipponensisKY606283.199.35 0.65 I.asanumaiAB231674.198.94 1.06 PC-ISP01基刺硬蜱I.spinicoxalisI.ricinusAY945444.185.1714.83YC-RMI09微小扇头蜱R.microplusR.microplusKT906178.199.55 0.45 R.microplusKT906180.199.55 0.45 FZ-RSA01血红扇头蜱R.sanguineusR.sanguineusJX416302.1100 0 R.sanguineusKX383817.1100 0

注：经BLAST同源性比对后，参考株的选取规则为1若序列相似度最大值>90%，则选取所有相似度>90%的物种，但种名相同的多株只选取相似度最高的两株;2若序列相似度最大值<90%,则选取相似度最高者。

形态上很难或不易区分，但是相互间存在生殖隔离的一组物种，被称为隐存种[20]。随着DNA分类方法的发展和应用, 物种隐存多样性越来越多地被发现。Leo等[6]研究发现在COI与16S rDNA基因的系统发育树上，D.albipictus均出现2个支系,其平均遗传差异分别为7.1%与4.5%。 Li等[13]分析了云南省中缅边境腾冲县硬蜱的遗传多样性，通过COI及16S rRNA基因的遗传分析显示，通过形态学鉴定为R.microplus、R.haemaphysaloides、I.ovatus、H.longicornis、H.shimoga和H.kitaokai

注:图中分支上数值为1 000次自展检验置信度，标尺示遗传距离，样本编号见表1,登录号见表2。图1 基于COI 基因核苷酸序列用Kimura-2-parameter 模型构建的蜱类邻接系统发育树Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of ticks based on nucleotide sequence of COI with Kimura 2-parameter model

等6个蜱种均存在2个或3个隐存的复合群，群间遗传距离超过了通常的种内遗传距离。本次对微小扇头蜱与卵形硬蜱的研究结果与之相符。这也说明蜱类的隐存多样性在自然界中较广泛地存在着，这些隐存种的发现为我们重新认识蜱类生物多样性提供了可靠的证据。

由于蜱的形态学鉴定比较困难，尤其是同亚属内的蜱种形态极为相似，常常误定[21]。本研究实验室成员已对福建省所有留存的蜱类标本进行重新观察鉴定，并经军事医学科学院许荣满教授复核，修正了以往文献中误定的种类[22-23]。本研究通过COI基因序列差异性比较及系统发育树构建，发现一些种类的DNA条形码鉴定结果与形态学鉴定不符，考虑有以下原因：①GenBank中上传的原始数据可能出现形态学鉴定错误，有文献[22-23]将台湾革蜱误定为D.auratus与D.steini，数据库中与台湾革蜱高相似度的金泽革蜱和斯坦因革蜱是否存在误订有待进一步核实。②实验用样本的种名与数据库中相似度高的参考株种名可能是同种异名，我们将中华硬蜱与I.nipponensis的形态描述[24]作了比较，发现两者形态特佂并无明显差别，考虑中华硬蜱可能是I.nipponensis的异名,还需进一步核实。③COI基因片段信息含量较少，以及近缘种之间出现的基因交流现象，可能导致目的序列与其他种的序列极为相似[25]。DNA条形码技术应用于蜱类的研究尚处于起步阶段，上述3种原因难以避免，Zhang等[8]从GenBank 与BOLD中下载667条蜱类COI序列进行遗传距离的研究，发现一些不同蜱种之间出现了很低的遗传差异并意外聚类，表明DNA条形码的成功鉴定高度依赖于准确的形态学鉴定。因此，我们认为现阶段DNA条形码技术用于蜱类鉴定尚不能脱离传统的形态学鉴定而独立进行，必要时，还需联合多分子标记来综合研判，防止研究结果出现偏差[26]。

综上所述，基于COI基因的DNA条形码鉴定技术不受物种发育阶段及个体形态特征的影响，还能发现形态学鉴定无法辨认的隐存种，这些优势是传统形态学无可比拟的。本研究结果显示COI基因的DNA条形码测定是一种快速、准确的蜱类鉴定新兴技术，然而在现阶段，COI基因DNA条形码技术尚不能完全脱离传统的形态学鉴定而独立进行，两者应有机地结合起来，更好地发挥各自的优势，以达到对蜱类准确高效地鉴定。

利益冲突：无

引用本文格式：周淑姮，肖方震，刘维俊，等.COI基因DNA条形码技术在福建省蜱类鉴定中的应用[J].2020,36(01):25-31.DOI：DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.104