贝类精氨酸激酶致敏性的研究进展

赵晓涵，张江涛，李国明，朱艳，谷瑞增，鲁军

中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心（北京 100015）

食物过敏（FA）又称为食物变态反应，是因为人们食用某种食品或食品添加剂后引起的IgE介导或非IgE介导的异常免疫反应，从而使人体的组织系统产生多种不良症状。任何食物都可能诱发变态反应，各种食物和制备方法是每个群体文化特征的一部分，因此引起症状的主要食物因地理位置而有所不同[1]。食物过敏原指的是能引起免疫反应的食物抗原分子。几乎所有食物过敏原都是蛋白质，大多数为水溶性糖蛋白，相对分子质量为10～70 kDa。食物过敏是一种日益引起人们重视的食品安全问题，也是儿童中最常见的慢性非传染性疾病[2]。目前尚无治疗食物过敏的方法，但在IgE介导的过敏管理方面取得令人兴奋的进展，包括通过预期筛查测试，早期引入常见食物过敏原，主动耐受诱导，使用生物制剂和主动风险管理[3]。有学者开发口服（OIT），舌下（SLIT）和表皮（EPIT）免疫疗法作为食物过敏的积极治疗，但没有人完成3期研究[4]。此外，在高危婴儿中早期引入可能的食物过敏原以积极预防食物过敏将是减缓过敏率上升的重要手段[5]。虽然严格避免食用过敏食物是患者的最佳选择，但食物配料的多样化及组成的复杂性，容易发生过敏原的意外摄入和过敏反应[6]，而且患者在长期忌食过敏食物过程中，往往会导致营养缺失，容易发生病理性饮食行为，对患者及其家庭的生活质量产生重大影响[7]。目前主要研究的几种食物过敏治疗策略有望为患者提供治疗或长期缓解，但只有降低或消除过敏原的致敏性才是防止食物过敏的根本解决之法。

1 贝类过敏

由于烹饪的原因，甲壳类和软体动物这2种无脊椎动物通常被称为贝类。甲壳类动物与蛛形纲动物和昆虫一起统称为节肢动物。在世界范围内发现5万多种活甲壳类动物，许多甲壳类动物都可以生吃或熟吃。软体动物也是一个庞大而多样化的群体，细分为双壳类、腹足类和头足类，包括近10万种不同的物种，包括一些具有重要经济价值的海鲜类，如贻贝、牡蛎、鲍鱼和鱿鱼。贝类种类繁多，因其肉质肥嫩、营养丰富而深受消费者的喜欢，而且随着贝类养殖业、物流业和冷链的发展，贝类逐渐成为居民食物消费的重要组成部分，且消费市场不断扩大[8]。

贝类过敏作为食物过敏中的一种，主要是由IgE介导的体液免疫反应引起的Ⅰ型过敏反应[9]。过敏原通过摄入、吸入或接触进入机体后，诱发B细胞产生特异性IgE抗体，IgE与肥大细胞/嗜碱性颗粒细胞结合成为致敏靶细胞。当机体再次接触相同过敏原刺激时，过敏原就会与靶细胞上的IgE结合发生特异性反应，释放炎症因子作用于效应组织和器官，从而引发急性过敏反应，如哮喘、荨麻疹、流涕等[10]。在全球范围内，最常见的致敏贝类是虾、蟹、龙虾、蛤、牡蛎和贻贝。据估计，贝类过敏的患病率为一般人口的0.5%～2.5%，在中国沿海地区甚至是内陆地区，食用贝类后引起过敏反应的事件逐年增多。

不同贝类可能含有一种或多种过敏原。随着多种新型贝类过敏原的不断发现，已知的贝类过敏原有原肌球蛋白（TM）、精氨酸激酶（AK）、肌球蛋白轻链（MLC）、肌钙结合蛋白（SCP）、血蓝蛋白亚基（HCS）[11]等，因此，主要对精氨酸激酶AK过敏原进行介绍。

2 精氨酸激酶（AK）

精氨酸激酶是贝类中对热、酸、碱均不稳定的过敏原之一，尽管已观察到一些二聚体AK，但其通常以单体形式被发现。AK结构复杂，它由一个大的C端结构域和一个小的α螺旋形成的N端结构域组成，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域类似，7个α-螺旋将8股串起来的反平行β-折叠包绕起来。如图1所示。

图1 精氨酸激酶三维结构图

精氨酸激酶是无脊椎动物体内主要的磷酸原激酶，参与控制细胞的ATP水平，在无脊椎动物体内有调节能量代谢的作用[12]。不同贝类中，甲壳类动物如南美白对虾、斑节对虾、虾蛄中含量较多；软体动物如太平洋牡蛎、鱿鱼、缢蛏及蛤蜊中的相对含量则较少，说明在不同种类贝类中，AK的相对含量有较大区别[13]。精氨酸激酶在无脊椎动物中分布广泛，生理功能相似，根据蛋白质的四级结构及相对分子量，可以将精氨酸激酶划分为三类：单亚基精氨酸激酶，是这三类里目前研究较多的一种，如中国明对虾、海湾对虾、锯缘青蟹、牡蛎中的精氨酸激酶，相对分子量约40 kDa[14-15]；双亚基精氨酸激酶，如海参、北极贝、深海蛤蜊中的精氨酸激酶为二聚体[16-17]，其相对分子质量约80 kDa；四亚基精氨酸激酶，如环节动物，相对分子量为150～160 kDa。

泛过敏原是指具有免疫交叉反应性结构基础的一类过敏原[18]，这些过敏原的共同特点是它们在系统进化的过程中保持着较高的序列相似性。毛海燕[19]通过RACE的方法成功克隆拟穴青蟹AK的cDNA序列，其编码357个氨基酸，氨基酸序列分析结果表明，拟穴青蟹AK与其他甲壳类AK之间具有较高同源性，经软件分析表明甲壳类精氨酸激酶的活性位点在271～277位（CPTNLGT）氨基酸之间[20]。过去学者对AK研究主要集中于它在机体能量代谢调节和酶学性质方面的作用，直到2001年，Binder等[21]从102份对玉米面粉蛾过敏的患者血清中发现其中5份血清具有AK的特异性IgE抗体，证明AK是引起人对玉米面粉蛾过敏的过敏原，同时指出分子量40 kDa的蟑螂精氨酸激酶与蛾类、尘螨、龙虾、对虾、贝类有一定免疫交叉反应，说明AK是甲壳类动物、软体动物甚至昆虫中的泛过敏原。然而，大多数交叉反应性研究是基于分子和免疫学发现，而不一定是基于临床反应性[22]。尽管AK在甲壳类和软体动物之间的交叉反应性被广泛报道，但对其分子特性研究还很有限。对AK的分子研究表明，一些AK氨基酸序列的高同源性导致该蛋白的三级结构（蛋白折叠）具有高相似性，从而可能导致交叉反应[23-24]。精氨酸激酶作为过敏原的研究尚处于起步阶段，Yu等[25]发现虾类的新精氨酸激酶过敏原Pen m 2，与过敏血清的反应率为33%～39%，该蛋白由359个氨基酸残基组成，广泛存在于各种甲壳类动物中，如虾、蟹等。García-Orozco等[26]纯化太平洋白虾的精氨酸激酶，并对其扩增测序，指出其是首次报道的太平洋白虾过敏原，与Pen m 2有96%同源性。

3 精氨酸激酶的致敏性与抗原表位

研究表明，过敏原能够引发过敏反应的物质基础是抗原表位，也称为抗原决定簇，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，一般位于抗原分子的表面。抗原表位能够被特定的抗体或免疫细胞受体识别，从而引起免疫反应。贝类AK引发的过敏反应是由IgE介导产生的，因此国内外对贝类AK过敏原表位的研究主要集中于解析其IgE结合位点[27]。在食物过敏原抗原表位的研究中，一般根据表位的结构将其分为构象型（不连续型）和线型（连续型）两种。深入研究食物过敏原抗原表位可以指导科研人员选择有效的理化和生物方法来降低甚至消除贝类过敏原的致敏性。过敏原检测和免疫治疗都基于抗原表位，运用分子生物学、蛋白组学、免疫学等方法对过敏原中特定氨基酸残基及其位置进行确定，将有利于过敏原检测和免疫治疗[28]。

3.1 构象表位与致敏性

构象表位是一些在一级结构中不连续但在空间上相互接近的氨基酸残基或肽段组成的能被特异性IgE抗体识别的区域，其致敏性依赖于抗原分子的空间结构[29]。因为构象表位是通过蛋白质折叠产生，所以定位其表位具有挑战性。某些食物过敏原经过加工处理或消化后，蛋白构象发生变化，使蛋白分子内部的表位暴露出来，从而易于体内抗体识别，或者由于构象改变产生新的抗原表位，使其致敏性升高。另一些过敏原经过蛋白变性或消化后导致部分或全部构象表位被破坏使致敏性下降甚至消失。此外，也有一些过敏原的致敏性不会因加工处理而发生明显变化，这是因为其抗原表位既没有被破坏也没有新的抗原表位曝露出来[30]。

3.2 线性表位与致敏性

线性表位，也称连续型表位，是在一级结构上连续的氨基酸残基或肽段构成的能被抗体分子识别结合的小肽段。许多蛋白在经过加工处理后失去原有的构象结构，或是在消化后产生的小分子肽段依然具有一定致敏性，所以在食物过敏反应中有些线性表位不仅是构象表位的组成部分，也能单独发挥作用[31]。

3.3 精氨酸激酶表位与致敏性的研究进展

Ayuso等[32]确定凡纳滨对虾中的AK（Lit v 2）过敏原的8个线性表位（AA：1～18，25～42，64～96，121～141，142～159，160～192，232～255和319～342）。Mao等[33]通过对拟穴青蟹AK的分段表达，确定2个主要抗原表位区域（AA：174～181和253～256），并且通过重叠肽库技术确定3个线性表位（AA：127～141，141～155和21～225），对克氏原螯虾AK、南美白对虾AK和章鱼AK的构象型抗原表位的预测，结果发现它们与拟穴青蟹AK具有相似的构象型抗原表位。杨阳[34]通过噬菌体展示技术结合重叠肽技术、细胞模型确定拟穴青蟹AK的4个线性表位：L-AK-1（AA 113～127），L-AK-2（AA 127～141），L-AK-3（AA 141～155）和L-AK-4（AA 204～218），应用噬菌体展示技术结合LocaPep软件分析得到拟穴青蟹AK的4个构象表位：C-AK-1（D3A4K43M1A5T49-T44I7），C-AK-2（L31K33V35T32E11E18F14S34D37），C-AK-3（V177G172M173D176Q178T174L181K175L187）和C-AK-4（R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145），拟穴青蟹AK致敏性随空间构象的变化而变化，其分子内部的Cys201和Cys271形成的二硫键是维持空间构象的关键位点，并通过小鼠动物模型进一步探究r AK1和r AK2的致敏性，确定AK的抗原表位优势区位于r AK1（AA：87～186）。毛海燕[19]发现拟穴青蟹AK的抗原表位以构象型为主，但血清学的Western-blotting分析证实AK中也含有线性表位。对于贝类AK的研究相对于TM而言较少且主要集中在提取纯化和分子克隆方面，贝类AK抗原表位的研究处于初始阶段。

不同贝类中AK蛋白结构均有所不同，利用不同加工方法或脱敏技术处理会破坏或修饰AK抗原表位，从而影响其致敏性。研究物理法（热处理、辐照、超高压等）、化学法（糖基化修饰、强酸、强碱、水解等）及生物法（酶解、发酵、基因突变等）的条件改变与贝类AK抗原表位关系的报道更是少之又少。对拟穴青蟹AK进行温度稳定性试验后发现AK为热不稳定蛋白，随着温度的升高，分子内部氢键及次级键逐渐被破坏，容易形成聚合物，导致变性、沉淀，因此以构象型表位为主的AK过敏原在经过高温处理后致敏性会显著降低。此外，拟穴青蟹纯化AK易被胃蛋白酶降解，对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化稳定性较强，但对致敏性的影响仍需深入研究。

4 结语与展望

有研究者对蟹AK的理化性质、消化稳定性、抗原表位、致敏性及其关键位点等方面进行初步探索，但仍存在一些问题需要深入研究，对其他种类的贝类AK过敏原，如软体动物AK也需进行全面分析研究，完善AK致敏性相关信息。制备高纯度的精氨酸激酶对其功能分析、特异性抗体制备及免疫鉴定显得尤为重要，只有对AK分子克隆技术进行详细探究，获得具有免疫活性的AK，才能加快AK检测和治疗方面研究；AK的主要表位类型是构象表位，但构象表位的研究是免疫学界的难题之一，对食物过敏原构象表位的分析多采用噬菌体展示肽库方法，可将该方法运用到研究AK过敏原的试验中，且随着现代分子生物学发展，有望找到快速绘制AK过敏原结构以及构象IgE表位技术；致敏性评估包括动物和细胞模型、胃肠道消化试验法、热稳定性试验法等，使用AK致敏性蛋白表位结构与致敏性评估结合的方法，分析构象变化与致敏性关系，探寻控制AK致敏性和脱敏新技术；研究不同加工方法对AK的结构及致敏性的影响，优化降低AK致敏性加工方法，开发出低致敏性甚至无致敏性的贝类食品。