乙酰胆碱酯酶生物传感器研究进展

吕晓平，郭利静，李宁，魏月*，杜海英

1. 河北农业大学理工学院（沧州 061100）；2. 河北省农产品加工工程技术研究中心（保定 071000）；3. 河北省农林科学院棉花研究所（石家庄 050051）

有机磷农药（Organophosphorus pesticide，OPs）是目前使用较为广泛的一类农药[1]，OPs中毒事件时有发生，2016年GB 2763—2016对各种常见农药的最大残留量做出了明确规定。当前常见的有机磷农药检测方法主要有高效液相色谱法[2]、气相色谱法[3]、酶联免疫法[4]、酶抑制法[5]等，这些检测技术各有优缺点[6]。生物传感器检测技术因其快速、高效、低成本等优点，在有机磷农药残留的检测中被广泛地应用[7]。近年来，应用乙酰胆碱酯酶生物传感器检测有机磷农药残留的研究尤为突出[8]，文章详细总结了这方面的研究成果。

1 乙酰胆碱酯酶生物传感器的工作原理及其研究进展

1.1 乙酰胆碱酯酶生物传感器的工作原理

乙酰胆碱酯酶生物传感器是利用乙酰胆碱酯酶作为识别和催化元件，乙酰胆碱酯酶与有机磷农药发生酶促反应，反应产物是一种电活性物质，该电活性物质与基体电极产生响应，基体电极使化学信号转变为电信号，从而完成对有机磷农药残留量的测定[9-10]。

1.2 乙酰胆碱酯酶生物传感器的研究进展

乙酰胆碱酯酶生物传感器的电极材料、酶的固定化研究以及酯酶本身的活性是相关研究的主要内容[11-12]。

1.2.1 电极材料

生物膜电极是乙酰胆碱酯酶生物传感器的核心部分。纳米材料由于优良的导电性、高灵敏度、响应时间短等特点成为理想的电极材料[13-14]。乙酰胆碱酯酶生物传感器中常用的纳米材料有金[15]、银[16-17]、碳[18]、复合材料[19]等，这些生物传感器对马拉硫磷、对氧磷、毒死蜱、敌敌畏等有机磷农药的检测准确度有较大幅度的提高，具体数据见表1。

表1 不同电极材料的乙酰胆碱酯酶生物传感器对有机磷农药残留量的检测限

接表1

1.2.2 酶的固定化方法

酶的固定化技术是利用载体将天然游离的酶束缚或限制在一定的空间中，保留其催化活性，是一种常用、便捷、有效的生物酶的修饰手段[20-21]。乙酰胆碱酯酶的固定包括将酯酶固定在酶膜上以及将酶膜固定在电极上两个过程，酶的最终固定结果将直接影响到检测的准确度、灵敏度以及响应时间，因此酶的固定化技术一直是近几年生物传感器研究的热点[22-23]。常见的酶的固定化方法包括物理吸附法、包埋法、共价键交联法等[24-25]。

1.2.2.1 物理吸附法

物理吸附法是最简单且不改变酶性质的方法，但这种方法利用酶与载体之间的弱作用力，易发生酶的脱吸附，不便于操作和保存[26]。Saleemd等[27]使用物理吸附法将乙酰胆碱酯酶固定在介孔硅的纳米通道上，该方法在较苛刻的条件下热稳定性能达到90 ℃，能重复使用3个周期，具有较高的实用价值。

但该方法最终仅能保留50%的酶活性，不便于乙酰胆碱酯酶的固有催化活性的保持，另外该方法在操作上有一定的难度。因此延长酶的保存期、提高酶的活性，是物理吸附法突破的关键。

1.2.2.2 包埋法

包埋法是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格或高分子半透明膜内的固定化方法[28]。Itoh等[29]将酶包埋在杂化介孔二氧化硅膜（F127-MST）中，成功制备了乙酰胆碱酯酶生物传感器的单元，将该单元用于检测敌敌畏、对硫磷等有机磷农药，检测限高于普通乙酰胆碱酯酶生物传感器，且稳定性和重复性都得到很大提高。

目前，该方法的不足体现在酶的催化速率较快的情况下反应产物累积较多，无法快速及时地释放到反应的溶剂中，影响反应速率严重时会造成膜材料的破裂。

1.2.2.3 共价交联法

共价交联法是将酶与载体通过共价键的相互作用固定到一起，此方法中最常用的交联剂是戊二醛[30]。Rui等[31]将AChe和牛血清蛋白（BSA）通过静电吸附作用，将其依次吸附在NH2-SBA-15表面，再加入戊二醛使AChe的氨基交联。在最佳固定化条件下，相对于游离AChE，固定化AChE（AChE-NH2-SBA-15）的比活性达到约95%，固定效率约为95%。

从以上实验数据中可得知，与物理吸附法和包埋法相比较，共价交联法更具优势。

1.2.3 乙酰胆碱酯酶活性的筛选

孙霞等[32]的研究结果表明鸭血清中的AChE酶含量丰富，对常见的有机磷农药较敏感，且来源广泛、廉价易得，是用于乙酰胆碱酯酶生物传感器上较理想的一种。

2 乙酰胆碱酯酶生物传感器的展望

随着现代生物技术、材料和化工等方面研究的不断发展，乙酰胆碱酯酶生物传感器正在由粗放到精细、由笨重向便捷化方向发展。乙酰胆碱酯酶生物传感器较常规的检测手段在准确度、响应时间、灵敏度等方面有较大的优势。然而，不可否认的是目前的乙酰胆碱酯酶生物传感器尚存许多亟待突破解决的问题[33-34]。

2.1 减少固定化酶过程中酶活力的损失

在固定化乙酰胆碱酯酶的过程中，化学试剂的使用使得很大一部分酶的活性降低甚至失去活性，这就造成了资源和资金的浪费，固定化酶的活性与重复利用周期由载体的特性与结构决定，如该材料的生物相容性与亲水性等[35-36]。因此，新型酶固定化材料的研究是未来固定化技术研究的一大重点。

2.2 提高酶的复活率、提升酶的稳定性

乙酰胆碱酯酶生物传感器中所使用的乙酰胆碱酯酶电极大多为一次性消耗品，无法重复使用，这就造成了每测定一种样品就要更换一次乙酰胆碱酯酶电极，不但增加了酶生物传感器的资金投入，而且还限制了生物传感器的自动化发展。如果能提高乙酰胆碱酯酶的复活率，使其可重复使用[37]，如Lan等[38]研发的基于金属螯合亲和固定化甲基对硫磷水解酶（Mph）光学生物传感器装置，用于有机磷化合物的检测，可以抑制酶活性的不可逆性，提高酶的抗干扰能力。如果合理利用该原理固定化乙酰胆碱酯酶，那么将大幅度提高酶的复活率、提升酶的稳定性。

2.3 向多酶化方向发展

因为酶特有的专一性和特异性，使得一种乙酰胆碱酯酶生物传感器只能测定出一种或一类有机磷农药[39]，而不能同时测定多种有机磷农药，这就给样品中各种有机磷农药的测定造成了困扰，因此多酶生物传感器检测多种农药是未来发展的一种趋势。

2.4 向微型、便捷化方向发展

传统的乙酰胆碱酯酶生物传感器体积都比较大，这就给野外作业或在其它比较复杂的环境下的检测造成了一定的困扰，因此微型化、便捷化也是生物传感器必然的发展方向[40]，如Mishra等[41]发明的可穿戴的手套生物传感器以及Guo等[42]发明的视觉筛选卡测定有机磷农药等方法就为未来生物传感器检测有机磷农药的研究提供了方向。

3 结语

综上所述，从乙酰胆碱酯酶生物传感器的新型电极材料、几类常用的酶的固定化方法、酶活性的筛选等方面阐述了乙酰胆碱酯酶生物传感器的研究成果以及存在的不足之处。

近年来，随着科技的进步与创新，有机磷农药的检测技术也在不断更新，乙酰胆碱酯酶生物传感器也已成为快速检验样品中有机磷农药的一种技术手段，为有机磷农药的快速检测提供了新方向。为现场检测和分析有机磷农药的小型、便携式、有不同固定化酶、可用于样品中多元混合物的分析与鉴别的乙酰胆碱酯酶生物传感器仍然是有机磷农药检测领域的一个重要发展趋势。