紫茄超氧化物歧化酶的提取及其活性测定

潘百明，苏辉兰，梁昌祥，覃晓婷

贺州学院（贺州 542899）

紫茄也称茄子、茄，为茄科植物，营养成分丰富，如含有胆碱、蛋白质、铁、维生素、钾等多种成分；紫茄中含超氧化物歧化酶（SOD）。SOD是生物体内氧自由基的天然清除剂，具有广泛的医用价值，可作为药品、食品及日化产品的添加剂。SOD产品对市场的需求量较大，试验采用邻苯三酚自氧化法[1]，从紫茄中提取SOD并测定其活性，为寻找更廉价易得的SOD产品提取原料提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜紫茄（市售）。

1.2 试验设备与仪器

HB-J 303打浆机（中山市汉宝隆电器有限公司）；H-1850 R冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；JY99-IIDN超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HH-S 2数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；723 N紫外-可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司。

1.3 药品与试剂

磷酸二氢钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸氢二钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（上海润捷化学试剂有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（成都市科龙化工试剂厂）；焦性没食子酸（国药集团化学试剂有限公司）；三氯甲烷（西陇化工股份有限公司）；无水乙醇（广东华光科技股份有限公司）；丙酮（西陇化工股份有限公司）；盐酸（西陇化工股份有限公司）。试剂均为分析纯。

1.4 试验方法

1.4.1 SOD酶液的提取

1) SOD提取

称取用蒸馏水清洗3遍紫茄40 g，放入打浆机中打碎，而后用纱布过滤残渣，加入3倍体积pH 7.8、0.05 mol/L的磷酸缓冲液，放入超声破碎仪中超声15 min，使SOD溶解到缓冲液中，然后再放入冷冻离心机中常温离心15 min，取上清液。

2) 除杂蛋白

将氯仿-乙醇混合溶剂加入上述上清液中，体积为上清液的0.25倍，搅拌15 min，以5 000 r/min冷冻离心机离心15 min，弃去沉淀，得到上清液为粗酶液。

3) SOD的沉淀分离

将粗酶液分为均等的5份，每份分别加入不同比例冷丙酮，粗酶液与冷丙酮的比例分别为1∶0.5（编号为①），1∶1.0（编号为②），1∶1.5（编号为③），1∶2.0（编号为④）和1∶2.5（编号为⑤）。均搅拌15 min，冷冻离心机离心15 min，离心转速为5 000 r/min，弃去上清液得到SOD沉淀。将沉淀先加入2 mL磷酸缓冲液，充分溶解后再加入3 mL缓冲液混匀。以5 000 r/min冷冻离心机再离心15 min，得到的上清液即为SOD酶液。

1.4.2 酶活性的测定

1.4.2.1 邻苯三酚自氧化速率的测定

取2支干净试管，1支为空白对照管，另1支为测定管。在两支试管中分别加入pH 5.2的0.1 mol/L tris-HCl缓冲液4.5 mL，再分别加入双蒸馏水4.2 mL，混匀置25 ℃恒温水浴中20 min。在空白管中加入0.3 mL的10 mmol/L HCl，测定管中加入0.3 mL的7 mmol/L邻苯三酚，使反应总体积达到9 mL。加入瞬间开始计时，4 min后迅速加入终止试剂8 mol/L HCl 1滴，混匀倒入比色皿。以空白管调零，选择波长420 nm紫外-可见分光光度计测定吸光度（A）。每30 s测量1次A，计算线性范围内每分钟的增量，得到每分钟邻苯三酚自氧化速率的吸光度A0。

1.4.2.2 SOD活性的测定

测定方法同1.4.2.1，测定管中加入0.1 mL的紫茄提取液①（②④④⑤），而双蒸馏水的体积相应减少。记录测定管加入酶液后每分钟SOD的吸光度A1[2]。

式中：9为反应总体积，mL；0.1为吸取提取液量，mL；N为样液稀释倍数。

总之，知识来源于实践。数学教学要尽可能地接近学生的现实生活，要尽量给学生提供合作的素材和机会。有效的课堂不仅有利于学生掌握知识，而且有助于学生提高能力。

试验得出最佳测定tris-HCl缓冲液pH。

1.4.3 反应温度对酶测定的影响

丙酮比例、tris-HCl缓冲液pH、反应时间控制为不变量，取反应温度分别为25，39，53，67和81 ℃。邻苯三酚自氧化速率的测定及酶活性的测定方法同1.4.2.1，试验得出最佳反应温度。

1.4.4 反应时间对酶测定的影响

丙酮比例、tris-HCl缓冲液pH、反应温度控制为不变量，取反应时间分别为20，30，40，50和60 min。测定方法同1.4.2.1，结果求得最优反应时间。

1.4.5 正交试验

为了确定各不同影响因素对紫茄提取测定SOD的最优工艺条件，根据单因素试验结果，以OD值为考察指标，选取丙酮比例、tris-HCl缓冲液pH、反应时间、反应温度为影响因素，各取3个水平，以L9(34)正交表设计试验，具体影响因素见表1。邻苯三酚自氧化速率的测定及酶活性测定方法同1.4.2.1。

表1 因素水平表

2 结果与分析

2.1 pH对SOD活性的测定结果

从图1可以看到，在只改变tris-HCl缓冲液pH，其他测定因素不变条下，最佳tris-HCl缓冲液pH 8.2，过酸或过碱都对SOD的测定有一定抑制作用，过酸或过碱会对SOD的“咪唑桥”结构会发生不可逆转变，导致酶活性丧失，原因是SOD中的Zn2+在酸性或碱性条件下极易脱落。SOD对pH的稳定性是由于金属辅基的存在，一旦去除金属离子，稳定性将大大降低。因此，测定SOD活性最佳的tris-HCl缓冲液pH为8.2。

图1 pH对SOD活性的测定结果曲线图

2.2 反应温度对SOD活性的测定结果

从图2可以看到，由于Cu/Zn-SOD存在“咪唑桥”结构，“咪唑桥”活性中心并非刚性的固定结构，而应该是一种柔韧灵活的结构，任何物理、化学因素都可以影响它；温度25 ℃时，各不同丙酮比例的酶液所测得的OD值均为最大值，说明超氧化物歧化酶对热敏感，温度较高容易失活，导致SOD得率较少，活性较低；SOD活力的最适温度在25～30 ℃，因此整个酶活力测定应在该条件下操作为佳。因此，测定SOD活性最佳的反应温度为25 ℃。

图2 反应温度对SOD活性的测定结果曲线图

2.3 反应时间对SOD活性的测定结果

从图3可以看到，反应时间20 min时，各不同丙酮比例的酶液所测得的OD值均为最大值，曲线图整体呈现先上升后下降趋势，随着处理时间延长，酶活力下降；40～50 min曲线下降较为平稳，虽然偶有上下波动，但幅度并不大，说明在此之间酶活性影响不大；试验表明，SOD活性最佳反应时间为20 min。

2.4 不同丙酮比例对SOD的提取结果分析

从图4可以看到，当反应时间、反应温度、tris-HCl缓冲液pH一定，丙酮比例1∶2时，SOD中蛋白质的沉淀分离效果最好，有利于保护酶活性，所以测得的活性也最大，OD值为288.94 U/mL。低于此比例的蛋白质的沉淀分离效果较差，而高于此比例所测得活性大小差不多，但丙酮用量较多，不利于成本节约，所以测定SOD活性最佳丙酮比例为1∶2。

图3 反应时间对SOD活性的测定结果曲线图

图4 不同丙酮比例对SOD的测定结果曲线图

2.5 正交试验结果

正交试验方案及试验结果见表2。由正交试验结果和极差分析可知，影响SOD测定结果的因素的主要顺序为：丙酮比例（A）＞tris-HCl缓冲液pH（B）＞反应温度（D）＞反应时间（C）。丙酮比例和反应温度对SOD的测定结果影响最大，所以必须选择最适合的丙酮酶液比并控制温度，各因素的最优组合为A2B2C2D2，即丙酮比例1∶2、tris-HCl缓冲液pH 8.2、反应时间20 min、反应温度25 ℃，在此最优测定条件下，SOD活性大小为296.36 U/mL。

表2 试验方案及试验结果

3 结论与讨论

采用邻苯三酚自氧化法测定紫茄中超氧化物歧化酶的活性，该方法具有操作简单且快速、试剂用量小等优点。通过对邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的试验条件进行初步探讨，试验结果表明，用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性的最佳条件为：tris-HCl缓冲液pH 8.2，反应温度25 ℃，反应时间20 min，丙酮比例1∶2。

从天然材料紫茄中提取SOD酶，材料成本相对廉价，材料供应充足，适合大规模工业化生产，对需求量日益增加的SOD市场具有很大的推广价值。另外，它符合人们“崇尚自然，回归自然”的心理需求，代表社会发展趋势。