提高人参茎叶皂苷中稀有人参皂苷含量的工艺
2020-03-13许凌巧王安琪何正有蒋用李佳毕建军
许凌巧，王安琪，何正有，蒋用，李佳，毕建军
成都大学四川抗菌素工业研究所（成都 610052）
人参茎叶皂苷是从人参（Panax ginsengC. A.Meyer）茎叶中提取出的一种富含人参皂苷类成分的提取物原料，广泛应用于药品、保健食品等领域。人参皂苷口服经消化系统水解后生成稀有皂苷和苷元才能被机体吸收利用，并发挥其药理活性[4]。人参皂苷Rg3、Rh2和Compound K是最具代表性的稀有人参皂苷，具有突出的抗衰老、抗肿瘤、抗自由基、保护神经和保护心血管等生物活性[1-3]。这3种人参皂苷单体已开发成自主知识产权的创新药物，表现出良好的临床应用价值。但由于稀有人参皂苷在自然界含量极低且化学合成难度高，使其在药物开发方面受到了限制。目前，人参皂苷Rg3、Rh2和Compound K主要由人参药材中的人参二醇型皂苷经水解制备而得[5-7]。但人参药材存在着生长时间长、售价高等缺点，制备底物成本过高，在一定程度上限制了稀有人参皂苷的产量和应用，故急需寻找一种低成本的原料用于制备稀有人参皂苷。人参茎叶皂苷原料相对易得、成本低廉，但其中稀有皂苷含量极低，采用制备稀有人参皂苷最为常用的微生物转化和酸水解方法[9-12]，通过研究其微生物和酸降解产物中稀有人参皂苷的含量，以期提高其中稀有人参皂苷的含量，不仅可以直接提高人参茎叶皂苷的药用价值，且此水解产物作为制备稀有皂苷的原料，可增加人参茎叶皂苷的附加值，为人参茎叶皂苷的二次开发和降低稀有人参皂苷制备成本提供了一种新的研究思路与开发方向。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人参茎叶皂苷提取物（中国·抚松县大自然生物工程有限公司，含人参皂苷＞80%），对照品人参皂苷Rg3、Rh2和Compound K（纯度：≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司），菌株Monascus purpureus Went（微生物菌种保藏中心），冰乙酸（成都市科隆化学品有限公司）、正丁醇（成都市科隆化学品有限公司），甲醇（成都市科隆化学品有限公司）等。
1.2 仪器与设备
立式压力蒸汽灭菌器（LDZM-80KCS-Ⅲ，上海申安医疗器械厂）、净化工作台（W-CI-1F，苏州净化设备厂）、Agilent 1260 Series高效液相色谱仪（包括G1312A Bin Pump，G1329A ALS，G1316A TCC，G1314B VWD）、分析天平（AE 240，瑞士METTLER公司）。
1.3 培养基
1.3.1 斜面培养基
100 mL培养液中含马铃薯20 g、葡萄糖2 g、硫酸镁0.15 g、磷酸二氢钾0.3 g、VB10.4片，琼脂粉1.5 g。
1.3.2 摇瓶种子培养基
100 mL培养液中含马铃薯20 g、葡萄糖2 g、硫酸镁0.15 g、磷酸二氢钾0.3 g、VB10.4片。
1.3.3 转化培养基
50 mL培养液中含马铃薯10 g、硫酸镁0.075 g、磷酸二氢钾0.15 g、VB10.2片、积雪草提取物添加量分别为0.2，0.4，0.6和0.8 g。
1.4 试验方法
1.4.1 对照品的制备
分别精密称取人参皂苷Rg3、Rh2和Compound K对照品5 mg定容至10 mL，各取0.5 mL混匀制成混合对照品溶液，过滤即得。
1.4.2 色谱条件
Agilent 1260 Series高效液相色谱仪，DiamonsilTMC185 μ m，4.6 mm×250 mm色谱柱，柱温30 ℃，流动相为甲醇：0.1%磷酸溶液（60∶40），流速1.0 mL/min，进样量10 μL。
1.4.3 制备方法考察
1.4.3.1 微生物转化
在超净工作台上，分别将菌种接于相应的斜面培养基上，在适宜温度下培养，直至长势良好。再将培养好的斜面的菌株转接于对应的摇瓶种子培养液中，放入恒温培养振荡器中，在一定的温度和转速下培养，直至各菌种长势良好。最后，以16%的接种量接种于转化培养基中，同时设有不接菌的空白对照组，均于28 ℃、以220 r/min培养数天。
1.4.3.2 酸水解
精确称取0.4 g人参总皂苷提取物，分别加入食用米醋、1%醋酸80 mL，在121 ℃反应30 min。将水解液pH调至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇层挥干溶剂。精确称取0.4 g人参总皂苷提取物，加入0.5%硫酸乙醇溶液80 mL，85 ℃下回流1 h。将水解液pH调至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇层挥干溶剂。将残渣用甲醇定容50 mL。进行HPLC检测分析，以人参皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量作为衡量标准。
1.4.4 单因素试验
1.4.4.1 酸浓度考察
分别加入浓度为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1%醋酸80 mL，在121 ℃反应30 min。将水解液pH调至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇层挥干溶剂。将残渣用甲醇定容50 mL。进行HPLC检测分析，以人参皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量作为衡量标准。
1.4.4.2 温度考察
分别在105，110，115，120，125和130 ℃下进行酸水解，反应30 min。将水解液pH调至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇层挥干溶剂。将残渣用甲醇定容50 mL。进行HPLC检测分析，以人参皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量作为衡量标准。
1.4.4.3 底物浓度考察
分别称取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 g人参茎叶皂苷进行酸水解，反应30 min。将水解液pH调至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇层挥干溶剂。将残渣用甲醇定容50 mL。进行HPLC检测分析，以人参皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量作为衡量标准。
1.4.5 正交试验设计
在单因素试验的基础上，为了获得水解的最佳工艺条件，采用正交设计法，选用混合正交表L9(34)进行表头设计，共设3个因素，分别为酸浓度、温度和底物浓度。按各试验号依次完成试验。最终以3种稀有人参皂苷总含量为指标，筛选得到最优工艺。
1.4.6 验证试验
按照正交试验结果中的最佳工艺组合将人参茎叶皂苷进行水解。重复3次。测定所得水解产物中稀有人参皂苷的含量，验证工艺是否稳定。
2 结果与分析
2.1 制备方法的确定
微生物转化与酸水解结果的对比结果如表1，由表中数据可知，以稀有人参皂苷总量为指标，转化效果：1%醋酸＞米醋＞微生物转化＞0.5%硫酸。微生物转化效果不如低浓度醋酸的效果，且酸水解更为简便省时。对比食用米醋、低浓度醋酸和硫酸3种有机酸的水解效果，结果表明：低浓度醋酸的转化效果最优，低浓度的硫酸得到的大部分是苷元，无法得到低取代的稀有人参皂苷。
表1 制备方法的筛选
2.2 单因素试验结果
2.2.1 酸浓度对水解结果的影响
从图1中可知，随着醋酸浓度的增加，稀有人参皂苷含量先增后减，醋酸浓度为0.6%时，3种人参皂苷的转化量都达到最高值，且3种人参皂苷的变化趋势都基本相同，故选定0.4%，0.6%和0.8%为正交试验醋酸浓度的3个水平。
图1 酸浓度对水解结果的影响
2.2.2 温度对水解结果的影响
从图2中可知：随着温度的增加，稀有人参皂苷含量先增后减，温度为115 ℃时，3种人参皂苷的转化量都达到最高值，且3种人参皂苷的变化趋势都基本相同，另外，温度过高会使试验操作存在安全问题且影响人参皂苷的稳定性。故选定110，115和120 ℃为正交试验温度的3个水平。
图2 温度对水解结果的影响
2.2.3 底物加入量对水解结果的影响
从图3中可知，随着底物加入量的增加，稀有人参皂苷含量先增后减，底物加入量为0.4 g时，3种人参皂苷的转化量都达到最高值，且3种人参皂苷的变化趋势都基本相同，故选定0.3，0.4和0.5 g为正交试验底物加入量的3个水平。
图3 底物加入量对水解结果的影响
2.3 正交优化
根据单因素试验的结果，选取影响提取率因素中有意义的水平做正交试验对结果进行方差分析，计算各因素平均值和极差，以确定最佳的提取条件（见表2～表4）。
方差分析结果表明：温度和底物加入量对转化效果均有显著影响（表4）。同因素中不同水平的结果均值反映了不同水平在此因素中对结果的影响，极差的大小反映了此因素的变化对结果影响的大小（表3）。从极差分析结果来看，3个因素对转化率的影响程度为：温度＞底物加入量＞酸浓度。温度的极差值最大，表明温度是影响转化率最为重要的因素。
表2 正交试验水平表
表3 正交试验结果分析
表4 方差分析结果
综上，最优组合为A3B1C3，即：醋酸浓度为0.8%，温度为110 ℃，底物加入量为0.5 g。此条件下转化产物中稀有皂苷含量达最高值。
2.4 验证试验
按照正交试验所得最优组合A3B1C3，即：醋酸浓度为0.8%，温度为110 ℃，底物加入量为0.5 g，进行验证试验并重复3次，试验结果见表5。结果表明此工艺稳定。
表5 验证试验结果
3 结论与讨论
试验通过单因素试验及正交试验优化建立了一种提高人参茎叶皂苷中稀有人参皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量的方法，探究了底物浓度、酸浓度、温度3个因素对稀有皂苷转化的影响，得到最佳条件为：底物加入量为0.5 g、酸浓度0.8%、温度110 ℃。此时，稀有皂苷Rg3的含量从1.8%提高到8.82%、Rh2的含量从0.2%提高到1%和Compound K的含量从0.4%提高到6.09%。
人参皂苷在人参根、须、叶等各个部位均有分布，其中人参叶中含量为7.6%～12.6%，其含量高于根部3倍[4]，人参茎叶廉价易得且总皂苷含量较高，适用于作为制备稀有人参皂苷的原料。此方法使用的醋酸浓度低、无毒性，后期无需考虑去除的问题，简单、快捷且易于工业化推广，既充分利用了人参资源，提高人参茎叶皂苷附加值，又为稀有人参皂苷的获得、开发与利用提供参考。
