2017-2019北京地区犬钩端螺旋体病流行病学调查

娄银莹，周梦洁，张颖欣，郑文潇，于咏兰

钩端螺旋体病(leptospirosis, 简称钩体病)是可感染人、犬及其他多种动物呈全球性分布的人兽共患病。其病原为致病性钩端螺旋体(简称钩体)。自1886年被报道以来，钩体就一直活跃于除南极洲以外的区域[1]。目前我国已发现并分离了75种血清型，18种血清群钩体，主要属于问号钩端螺旋体属(Leptospirainterrogans)和博氏钩端螺旋体属(L.borgpetersenii)[2]。由于地理条件、流行血清型的多样性，以及宿主动物地域性分布，中国不同地区人钩体病流行具有明显的特征[3]。

人或动物可通过接触污染的水源、土壤而感染。有的感染者无症状，其他或因急性肾功能衰竭、肝损伤或肺出血综合征等症状而危及生命[4]。犬作为钩体的重要储存宿主，可从尿液中排泄病原。当人与犬亲密接触时，增加了人暴露钩体病的风险。北京地区养犬数量巨大，但却缺乏犬钩端螺旋体流行情况的相关数据调查。因此掌握北京地区的犬钩体病流行特征对预防人钩体病具有公共卫生学意义。

1 材料与方法

1.1试剂 钩端螺旋体快速实时荧光聚合酶链式反应检测试剂盒购自北京世纪元亨有限公司。

1.2样品来源 2017年1月至2019年2月于中农大动物医院、流浪动物基地、犬舍随机采集北京各区犬血液、尿液样本各800份，样本均来源于不同的动物。其中医院样本916份，流浪动物样本392，犬舍样本292份。采集0.5 mL全血样品放入EDTA抗凝管中，保存于4 ℃冰箱；采集5 mL尿液样品装入洁净离心管，保存于-20 ℃于冰箱备用。

1.3 检测方法

1.3.1DNA提取 本实验采用钩端螺旋体快速实时荧光PCR试剂盒进行DNA提取，具体步骤如下：若为尿液样本，将尿液样本置于2 mL离心管中，13 000 r/min离心10 min，弃去上清，留沉渣200 μL于离心管中；直接吸取全血样本200 μL于离心管中备用；吸取RD消化液于离心管中，再加入20 μL RD蛋白酶K，混匀，56 ℃水浴3次，每次3 min；取出冷却后，加入300 μL的RD结合液，颠倒混匀，将离心管液体吸入吸附柱中，10 000 r/min离心1 min；弃去收集管中液体，吸取500 μL的RD洗涤液，10 000 r/min离心1 min；重复上述步骤1次；弃去收集管中液体，吸附柱放回空收集管中，13 000 r/min离心2 min，除去洗涤液；将吸附柱移入新的离心管中，于吸附柱中央加入30 μL洗脱液，室温放置2 min，10 000 r/min离心1 min，并重复步骤1次；DNA于-20 ℃保存。

1.3.2样本检测 采用北京世纪元亨公司快速实时荧光PCR仪进行钩端螺旋体的检测，其具体操作如下：取反应管放置室温融化，吸取模板2 μL加入反应管中，专用离心机离心1 min后，放入仪器中开始程序LEP(钩端螺旋体)的扩增检测。结果判定：若Ct值≤36并出现特征性扩增曲线，即为阳性；Ct值>36时，并出现特定的扩增曲线，需重新取样DNA进行扩增，如仍出现特定的扩增曲线，则可判定为阳性；其它情况均判定为阴性。

1.3.3PCR鉴定 对qPCR检测为阳性的样本，采用文献[5]报道的致病性钩体特异性扩增引物G1/G2和文献[6]报道的secY基因引物进行钩体菌属的PCR鉴定。

1.3.4血清学检测 将qPCR阳性病犬的血清样本送吉林大学动物医学院人兽共患病重点实验室进行显微凝集试验，对其进行血清群分型鉴定[7]。

1.4数据分析 采用χ2检验对流行病学风险因素如：区域分布、季节、个体差异等因素进行分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1犬钩端螺旋体感染情况 试验共采集样本1 600份(血液、尿液各800份)。采用qPCR方法检测犬致病性钩端螺旋体病原，结果共检测出17份(1.06%)阳性(见表1)。其中尿液阳性样本16份(2.00%)，血液阳性样本1份(0.13%)。尿液和血液样本检出率差别有统计学意义(χ2=11.653，P<0.01)，尿液样本检出率远远高于血液样本。

表1 犬钩端螺旋体qPCR检测结果
Tab.1 qPCR results of canine leptospira

2.2PCR与血清学检测结果 PCR鉴定结果显示，12份检测样本在285 bp或549 bp处出现特异性扩增条带。扩增产物测序后经GenBank序列比对鉴定为问号钩端螺旋体。此外12份送检血清样本经显微凝集实验检测抗体均为阳性(其中包含5份普通PCR扩增为阴性病例血清样本)，主要凝集血清群为澳洲群(9/12)、拜伦群(11/12)。综上，犬钩端螺旋体感染率为1.06%(17/1600)。

2.3 流行病学风险因素分析

2.3.1地区分布 如表2所示为犬钩端螺旋体感染样本的地区分布情况，样本遍布北京各个城区，但延庆和怀柔等地由于位置太偏，采集样本较少。各地区犬钩端螺旋体感染差异具有统计学意义(χ2=17.828，P<0.05)。

表2 犬钩端螺旋体感染与地区分布
Tab.2 Regional distribution of canine leptospira infection

风险因素感染/感染率(n=17)(%)未感染(n=1 583)χ2P地区17.8280.048① 东城0(0)81 西城0(0)100 石景山0(0)87 大兴0(0)120 昌平0(0)140 延庆0(0)6 顺义1(0.71)140 海淀5(2.75)178 丰台5(4.03)119 门头沟1(1.35)73 怀柔0(0)47 平谷0(0)74 密云0(0)55 朝阳4(2.84)137 通州1(1.19)83 房山0(0)82

注：①表示差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3.2季节分布 样本季节分布与感染情况如表3所示。不同季节钩体感染阳性率差异性较大，秋季钩体感染率(2.39%)显著高于其他3个季节，季节性差异有统计学意义(χ2=10.916，P<0.05)。

表3 犬钩端螺旋体感染与季节分布
Tab.3 Seasonal distribution of canine leptospira infection

风险因素感染/感染率(n=17)(%)未感染(n=1 583)χ2P季节10.9160.022①春季(3-5月)2(0.59)339夏季(6-8月)2(0.41)489秋季(9-11月)11(2.39)450冬季(12-2月)2(0.65)305

注：①表示差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3.3个体因素 样本个体因素(年龄、性别、品种以及来源)分布见表4。在年龄方面，以1～6y年龄段发病率最高，但与其他2个分组年龄段差异无统计学意义(χ2=1.103，P>0.05)。同样在性别方面，雄性犬较雌性犬高发，然而统计学显示性别间感染率差异无统计学意义(χ2=1.424，P>0.05)。

在来源方面，由于家养犬尿液样本收集较流浪犬和犬舍犬更容易，所以阳性检出率较高。患犬来源差异无统计学意义(χ2=9.432，P<0.01)。由于犬品种繁多，不利于统计分析，特简化品种分类，将其分为杂种犬和纯种犬。不同品种间感染率差异无统计学意义(χ2=0.427，P>0.05)。

表4 犬钩端螺旋体感染与个体因素
Tab.4 Individual factors of canine leptospira infection

风险因素感染/感染率(n=17)(%)未感染(n=1 583)χ2P年龄1.1030.613 <1 y2(0.99)200 1～6 y11(1.32)825 >6 y4(0.71)558性别1.4240.223 雌性3(0.55)545 雄性14(1.33)1038来源9.4320.0058① 家养16(1.75)900 流浪1(0.26)391 犬舍0(0)292品种0.4270.448 杂种犬14(0.74)539 纯种犬13(1.23)1044

注：①表示差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4阳性病例信息 17例病犬均表现为厌食、呕吐、腹痛、多饮多尿以及黄疸等一种或多种症状，且均未进行钩体疫苗免疫。病史信息统计显示患犬均曾接触死水或在野外游泳。电话回访发现，7例患犬表现出严重的肝肾损伤而死亡或被安乐死；其宠物主人目前尚未有感染钩体的症状。

3 讨 论

钩端螺旋体病是重要的自然疫源性疾病。我国受钩体病危害较大，虽然近年来(2001-2013年)钩体病流行率逐渐降低，但是病死率依然维持在1.10%～3.90%[8]。北京地区早在上世纪90年代就有关于人钩体病的报道[9]。犬作为我国华北地区钩体感染的主要宿主之一[2]，特别是在养犬数量最大的北京，对于人钩体病感染具有潜在威胁。

3.1感染情况 世界各地均有犬钩体病的报道：美国犬钩体病血清学阳性率为12%[10]，欧洲各地区PCR阳性率1.50%～8.00%不等[11]。我国关于犬钩体病的流行病学却报道不多。2010年齐海霞等[12]运用PCR方法获得北京地区犬钩体病阳性率为28.60%(尿液样本)，远远高于其他国家。本次试验得出北京地区犬钩端螺旋体分子流行率达1.06%，远低于前人试验结果，与试验选择的样本和区域范围有关。同时临床抗生素广泛使用，极大的降低了钩体抗原的检出率[13]，北京地区犬钩体病阳性率可能被低估。此外，试验发现尿液样本检出率高于血液样本(χ2=11.653，P<0.01)。急性期钩体病菌血症持续时间短[14]。所以在临床对疑似钩体病犬，我们要同时进行尿液PCR的检测。

3.2风险因素分析 任何年龄、品种和性别的犬都有感染钩体病的风险[15]。本次试验显示这三者均不是北京地区犬钩体病感染的风险因素。然而其他研究显示幼年犬的钩体感染率显著高于老年犬[11]。雄性犬感染率虽远高于雌性犬，但差异无统计学意义。这也与Koizumi等[16]人的研究结果类似。由于流浪犬和犬舍犬尿液样本获取困难，导致家养犬钩体阳性率显著高于其他来源的犬。虽然如此，这些家养犬的感染很大可能与野外游玩或接触水源密切相关。

季节变化与地区分布是犬钩体病感染的风险因素。钩体病是季节性疾病，我国人钩体病以夏季(7、8月)、初秋(9月)为流行高峰[3]。试验结果显示秋季钩体感染率显著高于其他季节，这也与美国[17]和瑞士[11]等国家犬钩体病流行情况一致。北京地处温带地区，钩体发病率较低。但犬钩体病在城区分布上呈现出差异性，高度提示在部分区域需要重视犬钩体病。

北京地区存在犬钩体病的流行，但容易被大众忽视。因此我们应当加强对宠物主人关于钩端螺旋体病的宣传教育，加强对宠物犬钩体疫苗的定期预防免疫，以降低犬钩体病带来的环境卫生风险。

利益冲突：无

引用本文格式：娄银莹，周梦洁，张颖欣，等.2017-2019北京地区犬钩端螺旋体病流行病学调查[J].中国人兽共患病学报，2020,36(1):56-59. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.182