四川石渠县牦牛源蜱感染斑点热群立克次体分子流行病学调查

刘城成，唐天才，塔 英，林宝山，袁东波，郭 莉，侯 巍，莫 茜，阳爱国，郝力力，李 锐

斑点热群立克次体 (spotted fever group rickettsia, SFGR) 属于立克次体目(Rickettsiales) 、立克次体科 (Rickettsiaceae) 、立克次体属(Rickettsia)，是一类专性细胞内寄生的革兰氏阴性原核微生物，多数为人兽共患病病原体，其引起的立克次体病在世界各地均有发生。人感染立克次体的病例在欧洲[1]、美洲[2]、澳洲[3]等国家均有报道，在我国的新疆[4]、黑龙江[5]、河南[6]等地区也从人体内分离到了具有致病性的立克次体。四川省石渠县(35°58′ 50.77″N, 98°06′10.58″E)是隶属于四川省甘孜州的纯牧业县，位于青藏高原东南缘，境内平均海拔4 200 m，辖区面积25 191 km2。牦牛是当地主要的家畜，由于经济发展相对滞后以及传统生活方式等因素影响，养殖方式粗放，驱虫意识淡薄，牦牛体表蜱虫寄生严重。由于当地牧民在放牧过程中与牦牛接触频繁，增加了感染相关蜱传病的风险。目前对该地区蜱种类以及斑点热群立克次体流行状况的研究均为空白。因此，本研究以牦牛体表寄生蜱为研究对象开展调查，以期掌握当地蜱的种类及其斑点热群立克次体感染的情况，为该地区蜱传病的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1蜱采集 于2018年3-8月从石渠县麻甲乡、德荣玛乡、阿日扎乡及长须干玛乡的牦牛体表采集蜱，装入收集管，塞入潮湿脱脂棉，放入75%酒精溶液中，并置于4 ℃冰箱保存待检。

1.1.2主要试剂 组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)、Trans 2K Plus DNA maker、2x EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金公司)、1xTAE溶液、琼脂糖、引物合成、测序均由生工生物工程技术服务有限公司(成都公司)完成。

1.1.3主要器材 电泳仪电源(DYY-6C型)购于北京六一仪器厂,Leica S9D体式显微镜购于中辉徕博(北京)仪器有限公司,台式高速离心机(eppendorf 5402型) 购于南京学静生物科技有限公司,Bio-Rad伯乐梯度PCR扩增仪(PTC240型)购于南京学静生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1蜱形态分类 根据《中国经济昆虫志》[7]，采用体式显微镜对蜱初步进行形态学鉴定，鉴定后选取每个地点不同种类蜱的20%进行分子生物学鉴定，最终确定种类。

1.2.2DNA提取 取出用75%酒精保存的样品，无菌水洗涤晾干后延纵向中轴线切割，分别装入EP管，半只于-80 ℃冰箱冻存，另外半只于玻璃研磨器中研碎。采用EasyPure Genomic DNA Kit按照说明书提取DNA，于-20 ℃保存备用。

1.2.3PCR检测 蜱及斑点热群立克次体的分子鉴定分别采用郭丽萍[8]和Oteo、Fernández de Mera[9-10]建立的方法，引物见表1。两种引物扩增均采用25 μL的反应体系，2x EasyTag PCR SuperMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、模板1 μL、ddH2O 9.5 μL混匀。设阳性对照(Rickettsia slovaca DNA由本实验室保存)和阴性对照(去离子水)。蜱16S rRNA基因扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温；立克次体ompA基因扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，40个循环；72 ℃延伸8 min；16 ℃保温；立克次体ompB基因扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94℃变性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，40个循环；72 ℃延伸8 min; 16 ℃保温。取2 μL PCR扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶中100 V电泳30 min，凝胶成像仪中观察结果。

表1 PCR引物
Tab.1 PCR primers

鉴定物种引物序列(5'-3')靶基因 产物大小 /bp参考文献蜱Tick16S+1:CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCGG16S-1:CCGGTCTGACAGATCAAGT16S rRNA460[10]立克次体Rr190.70p:ATGGCGAATATTTCTCCAAAAompA530 [11]Rickettsia sppRr190.602n:AGTGCAGCATTCGCTCCCCCTompB-F:GGGTGCTGCTACACAGCAGAAompB618[12]ompB-R:CCGTCACCGATATTAATTGCC

1.2.4序列分析及统计分析 阳性样品送生工测序，所得序列用DNA Star软件进行拼接分析，在NCBI中blast进行比对，再应用MEGA6.0软件以Neighbor-Joining法(bootstrap值1000)构建系统进化树，并用SPSS软件中pearson卡方检验对数据进行统计学分析。P<0.05差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1蜱采集数量及形态鉴定 在石渠县4个乡共采集到蜱818只，分别是长须干玛乡234只，麻甲乡224只、德荣玛乡192只及阿日扎乡168只，经鉴定，青海血蜱172只，西藏革蜱646只，形态特征分别如图1、图2所示。

A为青海血蜱背面；B为青海血蜱腹面图1 青海血蜱形态特征Fig.1 Morphological characteristics of Haemaphysalis qinghaiensis

A为西藏革蜱背面；B为西藏革蜱腹面图2 西藏革蜱形态特征Fig.2 Morphological characteristics of Dermacentor everestianus

2.2蜱16S rRNA基因扩增与遗传进化分析 以提取的蜱组织DNA为模板，扩增蜱16S rRNA基因片段，均出现目的条带，部分样本片段大小约430 bp，与预期相符。蜱16S rRNA基因序列经拼接、比对后共得7条，其中4条属于西藏革蜱，3条属于青海血蜱，分别命名为D.everestianus.shiqu1-4、H.qinghaiensis.shiqu1-3。选取BLAST比对后同源性最高的序列1-2条以确定种，即青海血蜱和西藏革蜱，再选取不同地点分离到的青海血蜱和西藏革蜱的16S rRNA序列，最后选取部分不同种类的血蜱和革蜱的16S rRNA序列等作为参考序列，构建进化树。如图3所示，4个革蜱分离株与西藏的西藏革蜱(KJ599809、KJ599803)亲缘关系最近，同源性达98.83%～98.89%。血蜱分离株则与甘肃临洮(MF629859)、甘肃永靖(MF629848)同源性最高，达99.08%～99.31%；与青海湟源(MF629882)同源性达98.33%～98.83%。

图3 基于16S rRNA基因蜱种系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of ticks based on 16S rRNA gene

2.3立克次体ompA、ompB基因PCR扩增 以提取的蜱组织DNA为模板，扩增立克次体ompA、ompB基因片段，长须干玛乡部分样本电泳如图4所示，ompA基因片段大小约530 bp，ompB基因片段大小约618 bp，与预期相符。

2.4立克次体PCR检测结果 立克次体检测结果如表2所示，在818只蜱中，有408只蜱检测到斑点热群立克次体，感染率为49.8%(408/818)，选择100个阳性样本进行测序并比对，其中未定种的立克次体约5%，劳氏立克次体约95%。在4个调查点中，德荣玛乡感染率最高，达58.3%, 其余依次是麻甲53.5%、长须干玛44.4%及阿日扎乡42.8%。德荣玛乡蜱斑点热群立克次体感染率高于其他3个调查点(χ2=7.175，P<0.05)。在麻甲乡青海血蜱斑点热群立克次体的感染率高于西藏革蜱(χ2=6.216，P<0.05)。

M：DL 5000 marker；1：阳性对照；2-9：蜱样本；10：阴性对照图4 长须干玛乡部份样本ompA、ompB基因PCR反应后电泳图Fig.4 PCR products of ompA and ompB gene of some samples in Changxuganma Village

表2 石渠县蜱立克次体PCR检测结果统计
Tab.2 Detection results of ticks-borneRickettsiain Shiqu County

调查点样本数阳性数感染率青海血蜱西藏革蜱合计青海血蜱西藏革蜱合计青海血蜱(%)西藏革蜱(%)合计(%)阿日扎0168168072720.0042.842.8麻甲172522241002012058.138.453.5*德荣玛019219201121120.0058.358.3长须干玛023423401041040.0044.444.4合计17264681810030840858.1*47.649.8

*P<0.05。

2.5立克次体ompA、ompB基因遗传进化分析 将立克次体ompA基因序列拼接、比对后共得4条序列(约530 bp)，分别命名为UnculturedRickettsiasp.shiqu1、R.raoultii.shiqu2-4，其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1与R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4有31个碱基的差异；R.raoultii.shiqu2与R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4仅有1个碱基差异；R.raoultii.shiqu3与R.raoultii.shiqu4仅有1个碱基差异。将其与GenBank中已有劳氏立克次体ompA基因进行同源性比较并且选取不同种类立克次体的ompA基因序列构建系统进化树，对种系亲缘关系进行分析。如图5所示，其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1与我国青海未定种的unculturedRickettsiasp.(MG228270)同源性达100%，与分离自韩国的长角立克次体CandidatusRickettsialongicornii(MG906676)同源性为98.21%，两者有9个碱基差异；R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4与分离自意大利的Rickettsiaroutliiz164(MH532249)、分离自我国北京的IM16株(KY474554)和分离自我国黑龙江Rickettsiaroutlii(JX885458)聚于同一分支，同源性为98.80%～99.39%；其中R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu4与我国西藏分离到的RickettsiaroutliiLYG32(JQ792137)同源性分别为99.6%、99.8%，R.raoultii.shiqu3与其同源性达100%；R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3与RickettsiaroutliiWYG68(JQ792162)同源性为99.80%，R.raoultii.shiqu4与其同源性达100%。

图5 基于ompA基因立克次体系统进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree of Rickettsia based on the ompA gene

将立克次体ompB基因序列拼接、比对后共得4条序列(约618 bp)，分别命名为UnculturedRickettsiasp.shiqu1、R.raoultii.shiqu2-4,其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1与R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4存在32个碱基差异；R.raoultii.shiqu2与R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4仅有1个碱基差异；R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4仅有一个碱基差异，将其与GenBank中已有劳氏立克次体ompB基因进行同源性比较并且选取不同种类立克次体的ompB基因序列构建系统进化树，对种系亲缘关系进行分析。如图6所示，其中UnculturedRickettsiasp.shiqu1与韩国分离到未定种的Rickettsiasp.(KC888953)和CandidatusRickettsialongicornii(MG906675)同源性达100%；R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3、R.raoultii.shiqu4与在俄国分离到的哈巴洛夫斯克株Rickettsiaraoultiistrain Khabarovsk(DQ365798)同源性分别为99.47%、99.31%、99.48%；与分离自意大利的Rickettsiaraoultiiz164(MH532272)同源性分别为99.30%、99.13%、99.31%。

图6 基于ompB基因立克次体系统进化树分析Fig.6 Phylogenetic tree of Rickettsia based on the ompB gene

3 讨 论

本次调查中4个乡均采集到西藏革蜱，而青海血蜱只在麻甲乡采集到。每种蜱都有特定的生存环境，西藏革蜱主要生存于我国西藏和尼泊尔海拔3 500～4 500 m以上的高山荒漠地区，青海血蜱主要生存于我国青海海拔2 000～4 200 m的草丛灌木[7]。就海拔和地理位置而言，阿日扎、长须干玛及德荣玛位于雅砻江流域亚寒带纯牧区，海拔在4 300～4 600 m；麻甲乡位于金沙江河谷寒温带半农牧区，海拔为3 799 m，两区的海拔高度存在明显的差异，这很可能是只在麻甲乡发现青海血蜱的主要原因。

在斑点热群立克次体的鉴定中，依据Fournie[11]建立的判定标准，ompA基因是斑点热群立克次体的特异性蛋白基因，如检出了ompA基因则可以判定为斑点热群立克次体，如没有，则判定斑点热群立克次体必须符合下列4项标准的中的两项：与16S rRNA同源性>98.8%、gltA同源性>92.7%、ompB同源性>85.8%、geneD同源性>82.2%。这是本研究以ompA及ompB基因作为靶基因检测斑点热群立克次体的依据。检测结果表明该地区蜱中斑点热群立克次体的感染率为49.8%。值得注意的是，在麻甲乡采集到青海血蜱的数量明显多于西藏革蜱，并且青海血蜱劳氏立克次体的感染率(58.1%)显著高于西藏革蜱(38.4%)。

在本研究中，阳性样本中劳氏立克次体占比高，劳氏立克次体于1999年首次分离自革蜱和扇头蜱，根据基因库中的信息，目前至少在19种蜱中检测到劳氏立克次体，包括草原革蜱、短小扇头蜱、嗜群血蜱、全沟硬蜱、钝眼螺旋蜱和亚洲璃眼蜱等革蜱属的蜱更多见携带劳氏立克次体[12]，但目前尚无关于西藏革蜱感染劳氏立克次体的数据。本课题首次在西藏革蜱中检出了劳氏立克次体DNA，并且有很高的检测阳性率。携带劳氏立克次体的血蜱主要有长角血蜱、短垫血蜱、草原血蜱[13]。在本次调查中，青海血蜱的劳氏立克次体感染率为58.1%远远高于高悦等[14]的检出率(14.9%(11/74))。此次调查的阳性样本中有5.0%为未定种立克次体Uncultured Rickettsia sp. shiqu 1，后期我们将应用诸如多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)等方法在种的水平上进一步鉴定。

2015―2016年，内蒙古、河南、山东省报道有26人感染劳氏立克次体[15]，从其中2例患者的血液中检测到并分离到劳氏立克次体哈巴洛夫斯克株R. raoultii strain Khabarovsk，该致病株与本次在石渠县牦牛体表寄生蜱中检测到的劳氏立克次体具有很高的同源性。因此，在石渠县西藏革蜱和青海血蜱劳氏立克次体高感染率的情况下，是否当地居民对其也具有一定的感染率有必要开展进一步的调查。

综上所述，本次实验首次对石渠县牦牛体表寄生的蜱虫种类及斑点热群立克次体流行情况进行调查，结果表明该地区青海血蜱和西藏革蜱是当地传播劳氏立克次体的重要媒介，并且首次鉴定出西藏革蜱也是携带劳氏立克次体的蜱种之一。石渠县蜱立克次体较高的感染率极大增加了人感染的风险，后期应进一步加强对蜱虫的控制及劳氏立克次体流行情况的监测。

利益冲突：无

引用本文格式：刘城成，唐天才，塔英，等. 四川石渠县牦牛源蜱感染斑点热群立克次体分子流行病学调查[J].中国人兽共患病学报，2020，36(1):50-55. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.183